【正文】 標記結(jié)合物的鑒定主要從標記結(jié)合比率、免疫活性、標記物活性等方面進行 。 本章小結(jié) 交聯(lián)劑分子兩端各有一個相同或者不同的活性基團，它們可與其他分子上的氨基、巰基、羥基等基團發(fā)生共價結(jié)合而產(chǎn)生交聯(lián)作用 。 一是用有支持膜的鎳網(wǎng)蘸取膠體金標記蛋白，在電鏡下測量顆粒的平均直徑；二是用免疫組化濾紙模型鑒定特異性和敏感性 。 第九節(jié) 膠體金與抗原抗體的結(jié)合物制備 一、 基本方法 膠體金標記就是蛋白質(zhì)等大分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程 。 三、量子點標記結(jié)合物的鑒定 量子點與抗原抗體結(jié)合物的鑒定可從光譜學特征、凝膠電泳、熒光成像、凝膠柱層析、點印記親和分析等方面展開。 二、 量子點標記結(jié)合物的純化 純化目的主要是：除去多余的交聯(lián)劑、未交聯(lián)的抗體以及未結(jié)合的量子點 。 共價結(jié)合法亦稱雙功能交聯(lián)試劑法 ，通過化學反應將量子點表面進行羧基、氨基、羥基或環(huán)氧基等活性基團修飾改性，使之能與生物分子共價偶聯(lián) 。 常用的雙功能螯合劑有 1（對 苯偶氮） EDTA、異硫氰酸苯基 EDTA、異硫氰酸苯甲基 EDTA和二乙烯三胺五乙酸（ DTPA）等 。 二、 化學發(fā)光劑標記結(jié)合物的純化 多數(shù)經(jīng)偶聯(lián)反應制備的結(jié)合物，使用前需采用透析法、凝膠過濾法或鹽析沉淀法等進行純化，目的是除去反應系統(tǒng)中存在的未結(jié)合的發(fā)光劑和交聯(lián)劑 。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冷凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經(jīng)復融。 常用的鑒定方法 ： 免疫電泳或雙相擴散法 常用免疫電泳或雙向擴散法，出現(xiàn)沉淀線表示酶標記物中的抗體（抗原）具有免疫活性 。 過碘酸鈉可將與酶活性無關(guān)的多糖羥基氧化為醛基，后者與抗體蛋白中的游離氨基結(jié)合形成 Schiff堿，再加入硼氫化鈉還原后，即生成穩(wěn)定的酶標記物 。但酶標記物的產(chǎn)率低，酶標記物易聚合，而且酶與酶、抗體與抗體之間也會發(fā)生交聯(lián)，影響標記物的質(zhì)量。 過量戊二醛 +酶 酶 戊二醛 抗體（抗原） 洗滌 Ab/Ag 戊二醛交聯(lián)法 戊二醛為同源雙功能交聯(lián)劑，它有兩個相同的醛基，可分別與酶分子和抗體 (抗原 )分子上的氨基結(jié)合 。 一般都是利用小分子上的活性部位與蛋白質(zhì)上的氨基、羧基、酚基、巰基或羥基進行化學反應 。 凝膠過濾法 將標記的抗體通過 SephadexG25或 G50凝膠柱，洗脫第一峰為熒光素標記抗體峰，第二峰為游離熒光素峰，收集第一峰即可。 透析法：適于標記樣品量少，蛋白含量低的抗體。 目前標記方法主要是透析法和攪拌法兩種 ： 以 FITC標記抗體（ IgG）為例： FITC含有異硫氰基，在堿性條件下能與 IgG的自由氨基結(jié)合，形成熒光抗體結(jié)合物。注意放射防護，廢棄物須按放射防護條例規(guī)定處理。 比放射活性是指單位質(zhì)量標記物中所含的放射性強度，也可理解為每分子抗原（或抗體）平均所結(jié)合放射性原子數(shù)目，常用 Ci/g或 Ci/mmol表示。 第三節(jié) 放射性核素與抗原抗體結(jié)合物的制備 重點提示 標記物與抗原抗體結(jié)合物的制備基本方法 標記物與抗原抗體結(jié)合物的純化 標記物與抗原抗體結(jié)合物的鑒定 標記物與抗原抗體結(jié)合物的保存 放射性核素與抗原抗體的結(jié)合物制備 一、 基本方法 氯胺 T(chT)法是常用的標記方法，氯胺 T是一種氧化劑，它能使 125I+液中帶負電荷的碘離子氧化成帶正電荷的碘，然后取代抗原酪氨酸殘基芳香環(huán)上的氫 chT是對甲苯磺基酰胺的 N氯衍生物鈉鹽，在水中易分解成具氧化性的次氯酸：次氯酸可將 125I﹣ 氧化成帶正電荷的125I+，后者可取代抗原（或抗體）中酪氨酸殘基苯環(huán)上的氫原子，形成穩(wěn)定放射標記物；最后加入還原劑偏重亞硫酸鈉（Na2S2O5）可終止反應 125I結(jié)合物制備 直接標記法 — 氯胺 T法 化學或酶促反應，將放 射性負電碘離子氧化成 碘原子或正電碘離子， 通過 取代反應 置換被標 記物分子中 酪氨酸或酪 胺殘基以及組胺殘基上 的氫原子。 如果第二種蛋白質(zhì)分子（ P2）不含巰基，可按反應（ 1）而得到 P2NHDTP，再與二巰基蘇糖醇（ DTT）起反應，將 DTP基還原成巰基，所得 P2NHCOCH2CH2SH，再按反應（ 2）方式交聯(lián)，制得結(jié)合物 II（ P1NHCOCH2CH2SSCH2CH2CONHP2） 。 非均一的雙功能交聯(lián)劑 N琥珀酰亞胺基 3(2吡啶基二硫 )丙酸醋 (SPDP)等屬于 非均一雙功能交聯(lián)劑 (heterobifunctional crosslinking reagent)。 碳二亞胺縮合法 碳二亞胺能激活蛋白質(zhì)分子上的羧基，反應生成一個肽鍵（ CONH），經(jīng)碳二亞胺縮合反應，蛋白質(zhì)分子中的游離羧基與標記物分子中的氨基形成較穩(wěn)定的酰胺鍵 。 大分子抗原、抗體的標記是利用雙功能交聯(lián)劑使標記物與被標記物結(jié)構(gòu)中的游離的氨基、羧基、硫氫基、咪唑基、酚基、羥基等基團形成不可逆連接 。 免疫標記常用交聯(lián)劑 分子兩端各有一個相同或者不同的活性基團，它們可與其它分子上的氨基、巰基、羥基等基團發(fā)生共價結(jié)合而產(chǎn)生交聯(lián)作用 。 膠體金制備方法 常用的方法為檸檬酸三鈉還原法 以制備 16nm的膠體金為例，取 %的氯金酸水溶液100ml，加熱至沸騰，磁力攪動下加入 1%的檸檬酸三鈉水溶液 2ml，淡黃色的氯金酸溶液很快變灰色，繼而黑色，隨后成酒紅色。 膠體金顆粒大小不同，呈色不同，光吸收性也不同 最小的膠體金 (2nm～ 5nm)是橙黃色，中等大小膠體金(10nm～ 20nm)是酒紅色，較大顆粒膠體金 (30nm～ 80nm)則是紫紅色 。 六、膠體金 膠體金（ colloidal gold） 也稱金溶膠，是金鹽被還原成金原子后形成的金顆粒懸液 。 水相體系 操作簡單、成本低廉、量子點表面形貌及性質(zhì)可控、易修飾各種基團 。 量子點調(diào)色功能 在紫外光激發(fā)下，相同組成不同粒徑的量子點的發(fā)射光譜 量子點的制備 大致分為兩種方法：物理制備法、