生物技術(shù)藥物質(zhì)量控制-文庫吧資料
2025-01-24 02:16本頁面
【正文】 一級結(jié)構(gòu)不含芳香族氨基酸，可不做紫外吸收光譜測定。 吸收光譜 ?對某一重組蛋白質(zhì)來說，其最大吸收波長是固定的。 ? 蛋白質(zhì)一般經(jīng)化學裂解法及蛋白酶裂解后用HPLC、 SDSPAGE電泳法、質(zhì)譜法測定。 ? 方法：等電聚焦電泳法 (IEF) 毛細管電泳法。 ? 凝膠過濾（分子篩）法：根據(jù)蛋白分子大小和性狀進行測定。 ? 抗體中和活性抑制法：此法可用于原液和成品的鑒別試驗，該方法簡便易行、要求抗體必須為 中和抗體 。 可根據(jù)物理化學性質(zhì)采用 Folin酚試劑法（ Lowry法 ） 、 染色法（ Bradford法 ） 、雙縮脲法、 紫外吸收法、 HPLC法和凱氏定氮等方法。 幾種檢定重組蛋白純度方法的比較 特性 HPLC SDSPAGE、 IEF CE 分離機制 極性、非極性分配， 電荷、等電點 電荷等 分子大小、離子交換 分析所需時間 10～ 120min 幾小時 10～ 30min 分辨力 好 好 好 樣品體積 10～ 50ul 1～ 50ul 1～ 50nl 靈敏度范圍 ng ～ ug ng～ ug pg 定量準確性 + 177。 HPLC法：分子篩、反相層析，離子交換層析，盡量采用與 SDSPAGE原理不同的反相或離子交換層析，不主張用分子篩分析。 非還原 SDSPAGE電泳法： 銀染加樣量 ≥ 5ug （ 1～ 10ng） 考馬斯亮藍 R250 加樣量 ≥ 10ug （ 100ng） 結(jié) 果：無明顯雜蛋白帶出現(xiàn)；目標蛋白量應(yīng)不低于總蛋白量的 95%或 98%。 純度的檢查通常是在 原液 中進行。 二、蛋白質(zhì)純度檢查 蛋白質(zhì)純度檢查是重組蛋白質(zhì)藥物地重要指標之一。 不同生物活性測定方法的規(guī)定標準表 測定方法 規(guī)定標準 動物基礎(chǔ)的生物活性測定 70%～ 130%標示量 細胞基礎(chǔ)的生物活性測定 80%～ 120%標示量 體外酶法的生物活性測定 85%～ 115%標示量 受體結(jié)合的生物活性測定 85%～ 115%標示量 生物學活性效價測定過程中 標準品的作用 生物學活性測定變異范圍大，同樣制品在不同實驗室測定結(jié)果差異很大，必須有一個統(tǒng)一的標準。 生物活性測定標準范圍確定 使用驗證過的測定和分析方法，并提供用此方法的效價測定平均值和單測定一批誤差的可信限范圍。 比活性可反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定情況，可比較不同表達體系、不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)同一產(chǎn)品時的質(zhì)量情況。 活性標準品 待測樣品 稀釋度 a b A值 生物學測定基本模式圖 蛋白質(zhì)藥物的比活性測定的意義 比活性：每毫克蛋白質(zhì)的生物學活性單位。 幾種細胞培養(yǎng)測定方法比較 3Hthymidine BrdU MTT Alamar Blue 靶向物 DNA合成系統(tǒng) 線粒體電子傳遞系統(tǒng) 檢出細胞的狀態(tài) 增殖 增殖、生存 檢出法 放射活性 色素、熒光 色素 色素、熒光 抽出的必要性 + + + 其他試劑的必要性 + ++ + 成本（以 MTT為 1時） 60 80100（試劑盒） 1 2 缺點 使用同位素 不適合 檢出大量未增殖 檢出未增 浮游細胞 細胞，處理時費力 殖活細胞 生物學活性測定分析方法 用能誘導(dǎo) 50%最大反應(yīng)的待測樣品最高稀釋度作為參考效價（或滴度），或以此稀釋度中所含樣品的量為 1單位，即以此稀釋度的倒數(shù)為待測樣品所含的單位數(shù)。 Alamar Blue：氧化型 Alamar Blue（ 600nm）可被活細胞中的線粒體酶還原，還原后染料（ 570nm）發(fā)生顏色和熒光改變，顏色和熒光的深淺與活細胞數(shù)成正比，可用分光光度計或熒光檢測儀檢測。 BrdU：首先用 BrdU做
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