生物技術藥物質量控制(已改無錯字)
2023-02-18 02:16:11 本頁面
【正文】 簡單、快速 熒光法 ～ 否 中等 較易 四、蛋白質藥物理化性質的鑒定 ? 特異性鑒別試驗 ? 相對分子質量測定 ? 等電點測定 ? 肽圖分析 ? 吸收光譜 ? 氨基酸組成分析 ? N末端和 C末端氨基酸測序 特異性鑒別試驗 ? 主要確定蛋白質的抗原性 ? 免疫學方法（免疫印跡、斑點免疫、免疫電泳、免疫擴散）：根據抗原抗體特異性反應建立的方法。 ? 抗體中和活性抑制法：此法可用于原液和成品的鑒別試驗，該方法簡便易行、要求抗體必須為 中和抗體 。 相對分子質量測定 ? 還原型 SDSPAGE：蛋白質在 SDS和 β 巰基乙醇存在下沸水浴 5min，形成表面帶大量負電荷的桿狀分子，降低了分子形態(tài)和電荷的影響，在電泳過程中蛋白遷移率基本只與其相對分子質量相關。 ? 凝膠過濾（分子篩）法：根據蛋白分子大小和性狀進行測定。 等電點測定 ? 重組蛋白質藥物的等電點往往是不均一的， 但在生產過程中批與批之間的電泳結果應一致， 以說明其生產工藝的穩(wěn)定性。 ? 方法：等電聚焦電泳法 (IEF) 毛細管電泳法。 肽圖分析 ? 肽圖 分析可作為與天然產品或參考品的蛋白質一級結構做精密比較的手段。 ? 蛋白質一般經化學裂解法及蛋白酶裂解后用HPLC、 SDSPAGE電泳法、質譜法測定。 ? 同種產品不同批次的肽圖的一致性是工藝穩(wěn)定性的驗證指標。 吸收光譜 ?對某一重組蛋白質來說，其最大吸收波長是固定的。 ?在生產工程中每批產品的紫外吸收光譜應當一致。 ?重組產品一級結構不含芳香族氨基酸，可不做紫外吸收光譜測定。 氨基酸組成分析 ?采用微量氨基酸自動分析儀測定，包括蛋白質水解，自動進樣、氨基酸分析、定量分析報告等。 ?有柱前衍生法和柱后反應法，前者是氨基酸先和熒光試劑作用生成衍生物，然后用色譜柱進行分離，檢測氨基酸衍生物的熒光；后者是氨基酸先用色譜柱分離，再與茚三酮、熒胺等試劑顯色后進行分析檢測。 N末端和 C末端氨基酸測序 ?作為重組蛋白質和肽的重要鑒別指標，一般要求至少測定 N末端 15個氨基酸、C末端 1～ 3氨基酸。 五、蛋白質的二硫鍵分析 ?二硫鍵和巰基與蛋白質的生物活性密切相關，發(fā)生錯誤配對，不但活性降低而且會引起抗原性增加。 六、對糖蛋白的特殊要求 ?評價用生物技術方法生產的糖蛋白時，應考慮糖基化位點的上調或下調及其對生物活性、代謝、穩(wěn)定性、溶解性的影響。每一種真核細胞具有其獨特的糖基化能力稱為它的糖類型，通過基因工程方法將一種糖蛋白在不同細胞中表達，可以導致生產不同類型的糖蛋白，即使在相同的細胞類型中，也可能會出現(xiàn)糖形成時由于一些寡糖的精細結構不同等而產生截然不同的糖蛋白。 七、殘余雜質檢測 對殘余雜質進行限制的意義 a、殘余雜質可能具有毒性，引起安全性問題； b、可能影響產品的生物學活性和藥理作用，或使產品變質； c、反映產品生產工藝的穩(wěn)定性。 殘余雜質檢測 殘余雜質分類 a、外來污染物：微生物、熱原、細胞成分（蛋白質、 DNA等）、培養(yǎng)基成分、純化步驟引入的成分（親和柱中的抗體、增溶用的 SDS）等； b、與產品相關的雜質：突變物、錯誤裂解物，二硫化物異構體、二聚體和多聚體；化學修飾形態(tài)（脫酰氨基或氧化形式、其他降解產物） 殘余雜質檢測內容 ?宿主細胞蛋白含量 ?宿主細胞 DNA ?鼠源型 IgG含量（ 10ng/劑量） ?蛋白 A含量 ?小牛血清殘留量 ?殘余抗生素（氨芐西林） ?內毒素含量（ LAL） ?產品相關物質 ?其他雜質（加入的離子、 SDS、甲醛等） 宿主細胞蛋白含量 ?以雙抗體夾心 ELISA為宜，盡量不用斑點免疫。 ?常采用 5種最常用的 為 ELISA測菌體蛋白含量的通用標準。 ?不同表達體系對菌體蛋白含量標準不同。 來自 %；來自 CHO細胞的產品為 不大于 %。 宿主細胞 DNA ?測定方法：采用 DNA雜交實驗，用固相斑點雜交法，以地高辛標記檢測試劑盒或者用同位素標記 DNA探針進行測定，必須提供相應宿主細胞 DNA標準品。 ?現(xiàn)行生物制品規(guī)程對宿主細胞 DNA殘留量標準作了相應調整： 由小于 100pg/劑量調整為 小于 10ng/劑量。 ?宿主細胞 DNA只作為一種細胞污染因素不作為一種 危險因素 。 安全性及其他檢測項目 ?無菌試驗 ?熱源試驗 ?異常毒性試驗 ?免疫原性檢查 ?水分、裝量、 pH檢測 生物技術藥物待測樣品保存 ? 生物技術藥物大多為具有生物活性的蛋白質、多肽，易受環(huán)境條件的影響。 ? 根據不同產品原液與成品、凍干與液體制劑的不同要求， 可選擇在－ 20℃ 、－ 80℃ 、4℃ 和常溫條件下保存。 ?冷凍保存的原液樣品最好分成小包裝保存，避免反復凍溶。 檢定方法的驗證 ?檢定方法的驗證就是根據方法的需要測定該方法的 專屬性、準確性、精密性、直線性、測定范圍、測定限度、 測量限度、 特異性和耐用性（或可靠性） 等幾個指標中的一個或幾個。對于理化測定方法已有了確定的要求和判定標準，而生物學測定的結果具有更大的可變性，一般要使用動物或細胞，這些有機體本身就具有較大的可變性，因此生物學測定的要求和合格標準要松一些。 驗證中需測定的參數 ?專屬性 /特異性 （ selectivity/specificity） 是指當檢測方法對測試樣品中含有制品中應有的其他化合物時，測定 待測物 的能力。本參數用于鑒別試驗、濃度或效力試驗和純度試驗的測定，以確定使用該檢測方法所測定的結果是否準確地反映了制品的鑒別、效價或純度。特異性就象準確性一樣，一般用偏差或測定值與已知值之間的錯誤率（ %）來表示。 直線性（ linearity） 是測定結果與樣品中測試物濃度的線性關系，該參數的測定將確定檢測方法的測量范圍，它可以表示為回歸直線的斜率和離散性，或者相關系數 R和測定系數 R2 。 測量范圍（
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