生物技術(shù)制藥-(已改無(wú)錯(cuò)字)
2022-09-01 18:09:41 本頁(yè)面
【正文】 用于 IgG類單克隆抗體的分離純化。在 ， IgG1和 IgG2能結(jié)合在 DEAE填料上，其中 IgG2a可在較低離子強(qiáng)度條件下洗脫下來(lái)，其純度較高。 IgG2b、 IgG3在低離子強(qiáng)度下易發(fā)生沉淀，可增加離子強(qiáng)度以提高產(chǎn)量，但其純度相對(duì)較低。在，把雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液加到瓊脂糖柱上時(shí)，所有的抗體都能結(jié)合到柱上，而 55%的雜蛋白可被洗脫掉，再用不同離子強(qiáng)度的洗脫劑洗下。 ? 續(xù)（ 2）離子交換法 ? 在最適離子強(qiáng)度及 pH條件下，以離子交換層析分離單克隆抗體可以純化 25~100倍。高容量、高流速、化學(xué)穩(wěn)定的新型離子交換劑適宜單克隆抗體的大規(guī)模純化。 ? （ 3）親和層析 ? 多用蛋白 A親和層析，適用于 IgG類單克隆抗體的純化。 IgG與蛋白 A的結(jié)合與 pH有密切關(guān)系，鼠源性單克隆抗體在 ， IgG2b、 IgG3幾乎全部結(jié)合于蛋白 A柱上， IgG1稍差，用 緩沖液可洗脫 IgG2b， IgG3， IgG2a， 脫下 IgG1。 用蛋白 A親和層析收獲的抗體純度很高，但也有極微量的雜蛋白。 第三節(jié) 鼠源性單克隆抗體 的改進(jìn) ? 改造鼠源性單克隆抗體的目的：一是降低免疫原性；二是降低相對(duì)分子量，增加組織通透性。 ? 如將鼠源性單克隆抗體的 C區(qū)用人的 Ig分子的 C區(qū)置換，則對(duì)人的免疫原性消失。對(duì)鼠源性抗體的改造已有很多成果報(bào)道，見(jiàn)書中表 44，給出了改造后的單抗的類型和特性：有人 鼠嵌合抗體（人 IgC小鼠 IgV， 150000）、 改形抗體（將小鼠 CDRs替換為人 CDRs， 150000）、 Fab(完整 L鏈和 Fd， 50000）、 FV（ VH和 VL， 25000）、 單鏈抗體（ SCFV， VH多肽 VL， 27000）、 單域抗體（ VH或 VL， 12500）、 最小識(shí)別單位（ MRU）（ 一個(gè) CDR， 2022）。 一、人 鼠嵌合抗體 ? 制備方法：提取雜交瘤細(xì)胞系的 mRNA， 經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA， 并以其為模板，采用特異引物，用 PCR方法分別擴(kuò)增 VL和 VH基因，再分別連接真核表達(dá)所需的上游啟動(dòng)子、前導(dǎo)肽序列和下游剪切供體信號(hào)、增強(qiáng)子真核調(diào)控序列后，將 VL基因克隆到人 Ig的 CL基因表達(dá)載體上，將 VH基因克隆到人 IgG1的 C基因真核表達(dá)載體上，再將人 鼠嵌合的 VC區(qū)基因質(zhì)粒 DNA等量混合，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0， 轉(zhuǎn)染后用含霉酚酸進(jìn)行篩選，形成集落的細(xì)胞即為共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所分泌的抗體為嵌合抗體。它保持鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合的特異性，但對(duì)人的免疫原性大幅下降了。如若用人 IgG1或IgG3的 C基因替換鼠 IgG1或 IgG2b， 則可有效地加強(qiáng)多肽的 ADCC效應(yīng)與免疫調(diào)理作用。 二、改形抗體 ? Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是 H和 L鏈 V區(qū)中的互補(bǔ)性決定區(qū)（ CDR區(qū)），而不是整個(gè)可變區(qū)。 H和 L鏈各有三個(gè) CDR， 其他部分稱為框架區(qū)。如果用鼠源性單克隆抗體的 CDR序列替換人 Ig分子中 CDR序列，則可使人的 Ig分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性。抗體分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。這種改形抗體（ reshaping antibody）又稱 CDR移植抗體（ CDR grafting antibody）。書中表 45給出幾種改形抗體及其潛在的臨床應(yīng)用。 三、小分子抗體 ? 基因工程小分子抗體僅表達(dá)鼠源性單克隆抗體的 V區(qū)片段，其相對(duì)分子量?jī)H為原抗體的 1/80~1/3。也就是說(shuō)，保留了 CDR區(qū)，而 Ig分子的 C區(qū)不表達(dá)?，F(xiàn)在研制的小分子抗體有以下幾種類型： ? （ 1） Fab抗體，由完整的輕鏈和重鏈（ VH和 CH1） 所組成。（ 2） FV抗體，由 VH和 VL組成，天然 FV片段中 VH和 VL為非共價(jià)性結(jié)合。（ 3）單鏈抗體（ single chain antibody SCA 或 single chain FV,SCFV）， 由 VH和 VL通過(guò)一段連接肽（ linker） 連接而成的重組蛋白。有分子量小、穿透力強(qiáng)、免疫原性小特點(diǎn)，可與效應(yīng)分子相連接構(gòu)建新功能抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體的理想元件。（ 4）單域抗體，由 VH(VL)單個(gè)可變區(qū)組成的，只有抗體分子的 1/12，而且表面疏水性強(qiáng)，與抗原非特異結(jié)合能力也強(qiáng)。（ 5）最小識(shí)別單位（ MRU）是由單個(gè) CDR區(qū)構(gòu)成的小分子抗體，親和力較低。 四、雙功能抗體 ? 雙功能抗體就是雙特異性抗體（ biospecific antibody, BsAb）。 它是一種非天然性的抗體，其結(jié)合抗原的兩個(gè)臂具有不同的特異性。 ? 化學(xué)交聯(lián)法 ? 生物學(xué)方法（雜種 雜交瘤）雜交瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞融合得到可分泌兩種親代抗體和雜種抗體的 雜種
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