【正文】 ↓ 將酶液在有機相 A中乳化、形成油包水的微滴。 （ 6）纖維包埋法 即前面已經(jīng)講述的酶布包埋方法。 （ 4）凝固包埋聯(lián)合法 在進行聚丙烯酰胺包埋時，將酶、混合單體、交聯(lián)緩沖劑一起混合，再加入催化劑，在單體產(chǎn)生聚合反應(yīng)形成凝膠的同時，將酶限制在網(wǎng)格之中，經(jīng)過破碎后就成為固定化酶。 （ 2）離子吸附法 將解離狀態(tài)的酶溶液與離子交換基混合后，洗去雜質(zhì)和未吸附的酶，即得固定化酶。 固定化酶的選擇 目前在工業(yè)化大生產(chǎn)經(jīng)常應(yīng)用的有： （ 1）聚乙烯醇 （ 2）卡拉膠 （ 3）海藻膠。 （ 2）固定化酶的穩(wěn)定性，能夠長期反復(fù)使用。 （ 8）廉價易得。 （ 6）進行共價鍵結(jié)合時，具有可活化基團。 （ 4）具有一定的親水性，并且具有良好的穩(wěn)定性。 （ 2）對酸堿具有一定的耐受性。 （四）細胞固定化的方法分類 （ 1）交聯(lián)法 （ 2）包埋法 （ 3）選擇性熱變性法 此法專用于細胞固定化，是將細胞在適當溫度下處理，使其細胞膜蛋白質(zhì)變性，但不使其酶變性，從而使酶固定于細胞內(nèi)的方法。 纖維包埋法所形成的聚合物，每克能夠包埋 1500mg的轉(zhuǎn)化酶，并且具有良好的穩(wěn)定性。 ? 微囊化固定化酶的缺點 反應(yīng)條件要求高，制備成本也較高。所用的凝膠有： ? 聚丙烯酰胺 聚乙烯醇 光敏樹脂 淀粉 明膠 膠原 海藻膠（卡拉膠） 角叉菜膠 （ 2）微囊化包埋法 ? 將酶包埋在高分子半透膜中的方法，稱為微囊化包埋法。 ? 包埋法分為三類 （ 1）凝膠包埋法 （ 2）微囊化包埋法 （ 3）纖維包埋法 （ 1）凝膠包埋法 ? 凝膠包埋法也稱網(wǎng)格法，是指將酶包埋在高分子凝膠的細策網(wǎng)格之中。 （ 2）交聯(lián)法的類別和內(nèi)容 ? 類別 酶與酶交聯(lián)法 酶與輔助蛋白交聯(lián)法 吸附交聯(lián)法 載體交聯(lián)法 ? 內(nèi)容 分子內(nèi)交聯(lián) 分子間交聯(lián) 酶與輔助蛋白分子之間交聯(lián) 酶與載體之間交聯(lián) （ 3）參與交聯(lián)的酶蛋白功能團和常用的交聯(lián)劑 ? 參與交聯(lián)的酶蛋白功能團 N末端的 α 氨基 賴氨酸的 ε 氨基 酪氨酸的酚基 半胱氨酸的巰基 組氨酸的咪唑基 ? 常用的交聯(lián)劑 戊二醛 雙重氮聯(lián)苯胺 2二磺酸 5二氟 4二硝基苯 已二酰亞胺二甲酯 包埋法 ? 包埋法的優(yōu)點 不需要改變酶的高級結(jié)構(gòu)，酶的回收率較高?；鶊F之間的交聯(lián)通過共價鍵結(jié)合。 B、共價鍵結(jié)合法的缺點 操作復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻，酶的活性中心會遭到部分性的破壞。 DEAE纖維素 AmberliteCG50 AmberliteXE97 AmberliteIR45 Dowex50 （ 3） 共價鍵結(jié)合法 酶分子上的氨基、羧基、羥基、咪唑基、巰基與載體表面的反應(yīng)基團形成共價鍵，因而將酶固定在載體上的方法。 B、離子結(jié)合法的缺點 載體和酶的結(jié)合力較弱、常常發(fā)生酶脫落的現(xiàn)象 C、常用的離子結(jié)合劑 樹脂 陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂、多糖類離子交換劑、合成高分子類離子交換劑。 纖維素 多孔玻璃 酸性白土 漂白土 高嶺石 氧化鋁 硅膠 膨潤土 羥基磷灰石 磷酸鈣 金屬氧化物 二氧化鈦覆蓋后的不銹鋼顆粒，直徑為100200um，每克載體能吸附 17mg酶蛋白。 （三）酶固定化的方法分類 載體結(jié)合法 交聯(lián)法 包埋法 載體結(jié)合法 （ 1）物理吸附法 （ 2）離子結(jié)合法 （ 3）共價鍵結(jié)合法 （ 1） 物理吸附法 A、物理吸附法的優(yōu)點： （ 1）操作簡單 （ 2）可選用不同的吸附劑 （ 3）酶失活之后，載體可以再生 B、物理吸附法的缺點： （ 1）酶的最適吸附量無規(guī)律可尋 （ 2）酶與載體之間的吸附力不強，酶容易脫落。 （ 5）酶的利用率高，酶的實際使用量較少。 （ 3）反應(yīng)以后，產(chǎn)物中不含酶，易于純化。 （二）固定化生物催化劑的特點 （ 1）固定化酶屬于修飾酶，這種酶可以通過化學(xué)、生物、分子工程手段加以改良。 ? 制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。 3， ↓ 得沉淀物，即為干粗酶 ↓ 加入甘氨酸， 60℃ 熱處理 30分鐘 ↓ 得酶溶液，加入聚乙二醇，在不同的 PH值下進行精制 ↓ 得無熱源酶液 ↓ 凍干、無菌分裝 ↓ 得天門冬酰胺酶凍干制劑 十四、尿激酶 藥理作用 是一種蛋白質(zhì)水解酶，具有溶血作用和降血壓作用 臨床應(yīng)用 抗血栓 生產(chǎn)方法 提取法生產(chǎn) 以男性新鮮尿液為原料進行提取。 臨床應(yīng)用 抗腫瘤制劑 （二）生產(chǎn)方法 （二）生產(chǎn)方法 ? 發(fā)酵法生產(chǎn) 以大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)。 3：生產(chǎn)方法 發(fā)酵法生產(chǎn) 以毛霉（米曲酶）發(fā)酵生產(chǎn)。 生產(chǎn)方法 提取法生產(chǎn) 以菠蘿的皮為原料進行提取。 十一、菠蘿蛋白酶 藥理作用 具有消炎、抗水腫的作用。 九、糜胰蛋白酶 藥理作用 是一種蛋白質(zhì)消化酶 臨床應(yīng)用 助消化，增加食欲 生產(chǎn)方法 提取法生產(chǎn) 以牛羊的腸粘膜為原料進行提取。 生產(chǎn)方法 提取法生產(chǎn) 以豬的胰臟為原料進行提取。能夠消化淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪。 生產(chǎn)方法 提取法生產(chǎn) 以豬的胰臟為原料進行提取。 六、彈性酶 藥理作用 能夠水解彈性蛋白、血纖維蛋白、血紅蛋白。能夠液化死細胞。能溶解血栓和滲出物的纖維部分。 臨床應(yīng)用 治療類風濕關(guān)節(jié)炎，自身免疫疾病、心肌缺血、抗衰老、斷肢再植、整形美容。 生產(chǎn)方法 細菌發(fā)酵法生產(chǎn)。 （ 2）為鏈道酶（ SD）、又稱為脫氧核糖核酸酶。 （ 1）為鏈激酶（ SK）、又稱為溶栓酶。 （ 2）提取法生產(chǎn) 以豬的胰臟為原料進行提取。 臨床應(yīng)用 治療動脈硬化、血管炎、四肢皮膚潰瘍。 ? 融合菌株的生產(chǎn)性能比親株高出 30%。 ↓ 待原生質(zhì)球形成之后，以 40006000r/min離心 2次，每次 15分鐘， 洗滌 23次、離心 ↓ 放于無菌蒸餾水中，使原生質(zhì)體膨脹 ↓ 適當稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基上 ↓ 32℃ 下、培養(yǎng) 20小時 ↓ 得原生質(zhì)體 D、細胞的再生 ? 取原生質(zhì)體，放入 NaCl溶液之中 ↓ 適當稀釋，涂布于完全培養(yǎng)基上 ↓ 32℃ 下、培養(yǎng) 24小時 ↓ 得原生質(zhì)體再生的細胞 E、原生質(zhì)的融合 ? 取等量的二親本原生質(zhì)體、加入 SMM溶液混勻 ↓ 經(jīng) 4000r/min離心 25分鐘，棄上清液 ↓ 加入由 SMM配制的、含 30%的、分子量為 6000的 PEG24ml 在 40℃ 下攪勻、保溫 23分鐘。 C、原生質(zhì)體的制備 ? 二親本接種入完全培養(yǎng)基， 37℃ 搖瓶培養(yǎng) 20小時 ↓ 離心收集菌體，懸浮于 0。 原生質(zhì)體誘導(dǎo)實際生產(chǎn)例子 ? 蛋白酶產(chǎn)生菌種之間的原生質(zhì)體融合共分為 7步： A、使用的親本菌株 B、菌株標記的獲得 C、原生質(zhì)體的制備 D、細胞的再生 E、原生質(zhì)的融合 F、融合子的繼代培養(yǎng)、檢驗和生產(chǎn)性能 A、使用的親本菌株 ? 二親本為： （ 1）枯草桿菌 （ 2）地衣芽孢桿菌 ? 二者都是野生型，對利福平和鏈霉素敏感。不同種屬之間也可進行融合。 有人在研究霉菌的淀粉酶基因、或者纖維素基因克隆到酵母菌中，一旦獲得成功，就能夠利用淀粉、纖維素為原料，以酵母菌作為載體，通過發(fā)酵來生產(chǎn)酒精。 （ 2）采用基因工程