【正文】 適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源 DNA的狀態(tài) ，然后利用短暫熱休克使 DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主中 。 根據(jù)所采用的載體的性質(zhì) ， 將重組 DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法 。 ? T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于： ? １ 、 連接具有同源互補(bǔ)粘性末端的ＤＮＡ片段； ? ２ 、 連接雙鏈 DNA分子間的平端； ? ３ 、 在雙鏈平端的 DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子 。 一、 DNA連接酶 ? DNA連接酶催化兩條雙鏈 DNA片段相鄰的 5’磷酸和 3’羥基間形成磷酸二酯鍵 。 DNA擴(kuò)增 PCR反應(yīng) DNA片斷的克隆 載體的條件 ： a 復(fù)制起點(diǎn) b 適宜的限制酶切點(diǎn) c 選擇標(biāo)記 ? DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組 DNA技術(shù)的關(guān)鍵 。 ? 使 DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開(kāi)始合成（鏈延長(zhǎng)）反應(yīng)。 ? 三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增基因片段 ? 對(duì)于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（ＰＣＲ），以基因組 DNA或 cDNA模板擴(kuò)增得到目的基因片段?？扇コ婧松锘蛑胁槐磉_(dá)的內(nèi)含子。 目的基因的獲取 ? 一、通過(guò)建立基因文庫(kù)分離靶基因 ? 基因文庫(kù)包括兩類：基因組文庫(kù)：利用限制性內(nèi)切酶。 載體應(yīng)具備以下條件： ? １、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制； ? ２、具有多種限制酶的單一切點(diǎn)（即所謂多克隆位點(diǎn)）以便外源 DNA插入； ? ３、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽(yáng)性與陰性重組分子； ? ４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時(shí)載體 DNA與宿主 DNA便于分離； ? ５、對(duì)于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等基因表達(dá)元件。 它們之間是互補(bǔ)的 ， 在適當(dāng)條件下可以再連接一起 。 常用的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng) ? 自然系統(tǒng) ? 人工誘導(dǎo)（完整細(xì)胞） （ 1）二價(jià)陽(yáng)離子系統(tǒng)： Ca2+， Ca2++Mg2+， Mg2+，Ca2++輔助噬菌體， Tris+Ca 2+ （ 2）單價(jià)陽(yáng)離子系統(tǒng)： PEG+Li+/Cs+/Rb+ （ 3）凍融系統(tǒng) （ 4） Triton處理：人工誘導(dǎo)（ PEG/原生質(zhì)體） 重組 DNA中常用的工具酶 ? 包括限制性核酸內(nèi)切酶 、 DNA連接酶 、DNA聚合酶 、 逆轉(zhuǎn)錄酶等 . 限制性內(nèi)切酶 ? 切開(kāi) DNA分子所需的酶：每一種酶都有其各自的作用位點(diǎn) 。 13．于 37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜。再插入冰中．加入 37℃ 靜置培養(yǎng) 90min。 10．加入 1～ 20μ l待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 DNA溶液。 7．加入 1ml ／ L CaCl2，再加 CaCl2，置冰浴中放置 20min。 4．當(dāng)培養(yǎng)物 OD600在 ～ ，開(kāi)始收獲細(xì)胞 (大約需 2～ )． 5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻 10min。 2．取 50ml肉湯中，無(wú)菌添加 ／ LMgCl2，于 37℃ 振蕩培養(yǎng)。 四、遺傳轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化是指受體細(xì)胞直接攝取供體細(xì)胞游離的DNA片段，將其同源部分進(jìn)行堿基配對(duì)，組合到自己的基因中，從而獲得供體細(xì)胞的某些遺傳性狀。在實(shí)驗(yàn)室條件下，質(zhì)粒也可經(jīng)人工手段將其轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞內(nèi)。 質(zhì)粒載體 二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細(xì)胞的不同表現(xiàn)型 抗生素抗性：抗生素的產(chǎn)生；大腸桿菌素的產(chǎn)生；腸毒素的產(chǎn)生；復(fù)雜有機(jī)化合物的降解；限制性核酸內(nèi)切酶和修飾酶的產(chǎn)生；殺傷性能。不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異 ， 同一質(zhì)粒在不同條件下 ， 拷貝數(shù)也可能差異很大 ， 有嚴(yán)緊型和松弛型兩種 。 基因重組 一、質(zhì)粒的特點(diǎn) 質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動(dòng)必需 。 第六節(jié) 基因育種 ? 基因重組育種：是運(yùn)用體外 DNA各種操作或修改手法獲得目的基因 ， 再借助于病毒 、 細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體 ， 將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá) ， 或者通過(guò)細(xì)胞間的相互作用 ， 使一個(gè)細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另 — 個(gè)細(xì)胞的方法 。 ? 以不同組合的營(yíng)養(yǎng)混合物與融化涼至 50℃ 的 MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿 ， 然后在這些平皿上劃線接種各個(gè)缺陷型菌株于各相應(yīng)位置 ， 培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長(zhǎng)出可推知其營(yíng)養(yǎng)因子 。 培養(yǎng)后會(huì)在某組合區(qū)長(zhǎng)出 ， 就可測(cè)得所需營(yíng)養(yǎng) 。 生長(zhǎng)譜測(cè)定的方法 ? 將缺陷型菌株培養(yǎng)后 ， 收集菌體 ， 制備成細(xì)胞懸液 ， 與 MM培養(yǎng)基 (融化并涼至 50℃ )混合并傾注平皿 。 ? 此法缺點(diǎn)是 ， 結(jié)果有時(shí)不明確 ， 而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易 。 (三 )夾層法 ? 先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基 ， 凝固后涂上一層含菌的 MM， 凝固后再倒一薄層 MM瓊脂培養(yǎng)基 ， 培養(yǎng) 24h， 將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記 ，然后倒上一層 CM瓊脂培養(yǎng)基 ， 再培養(yǎng) 。 ? 用接種針或牙簽將 CM上長(zhǎng)出的菌落在 MM和CM兩副平板上接種 ， 依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種 ，然后一起培養(yǎng) ， 觀察其生長(zhǎng)情況 。 ? 此法要求平皿上菌落不能太多 ， 菌落之間應(yīng)有一定間隔 。 ? 5． 二平皿相同方位進(jìn)行比較 ， 即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長(zhǎng)出的菌落少于 GM平板上的 。 ? 3． 將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓 ， 此菌印模即復(fù)印于上 。 ? 具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法 ? 1． 將一較平皿直徑小 1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨 ， 用金屬夾夾住 ， 滅菌 。 ? 菌絲過(guò)濾法：對(duì)于霉菌 ， 因孢子生長(zhǎng)后會(huì)長(zhǎng)出菌絲體 ， 就可用濾紙過(guò)濾法將菌絲濾去 ， 而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過(guò) 。 由于細(xì)菌或酵母對(duì)一些抗生素敏感 ， 于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素 ，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死 ， 保存了缺陷型 。 要研究代謝途徑 ， 育種技術(shù)都必須有營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株為材料 。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的用途 ? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大 。 ? 與營(yíng)養(yǎng)缺陷型對(duì)應(yīng)的是野生型 。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡率。 3．誘變處理 吸取 MNNG溶液 lml，加入到 1m1孢子懸液中， 30℃ 振蕩 30min，立即稀釋 1000倍停止作用，然后以 102， 104兩個(gè)稀釋度分離培養(yǎng)，30℃ 3天后計(jì)數(shù)。 ? (二 )操作步驟 1． 單孢子懸液制備 取斜面 ， 加入 6ml ／ L ， 用接種環(huán)刮下孢子 ， 振蕩試管 ， 立即通過(guò)帶濾紙漏斗過(guò)濾 ， 由此制得單孢子懸液 ， 若孢子液渾濁狀 ， 其孢子濃度可達(dá) l06個(gè)／ ml， 此為待處理孢子懸液 。 其精確的作用機(jī)制尚不很清楚 ， 據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸 ， 直接作用于細(xì)胞內(nèi)的 DNA復(fù)制系統(tǒng) ， 從而誘發(fā)了變異 。 亞硝基胍誘變曲霉菌 ? N— 甲基 — N39。 6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 4．取未照射的制備菌液和照射菌液各 行稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。 在正式照射前 ， 應(yīng)先開(kāi)紫外線 10min， 讓紫外燈預(yù)熱 ， 然后開(kāi)啟皿蓋正式在攪拌下照射 10～ 50s。 將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過(guò)濾 ， 單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi) ， 一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá) 108個(gè)／ ml左右 ， 作為待處理菌懸液 。 (二 )操作步驟 1． 將細(xì)菌培養(yǎng)液以 3000r／ min離心 5min， 傾去上清液 ， 將菌體打散加入無(wú)菌生理鹽水再離心洗滌 。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約 ～ ，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示 ， 希望照射的劑量死亡率控制在 70～ 80%為宜 。 在以后的復(fù)篩階段 ， 還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離 ， 純化菌株 。因此在具體方法上就有差異 . 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來(lái)挑取參加復(fù)篩者 ， 而將 90%的菌落淘汰 。 初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的 ， 以量為主 。 這樣 ， 隱性的變異就會(huì)顯現(xiàn)出來(lái) ， 若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng) ，直接在平皿上分離就會(huì)出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時(shí)存在于一個(gè)菌落內(nèi)的可能 ， 形成混雜菌落 ，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來(lái)的菌株退化 。 這個(gè)過(guò)程對(duì)今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的 。 (三 )誘變處理 根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹 ， 結(jié)合誘變對(duì)象的實(shí)際 ， 設(shè)計(jì)誘變處理方案 。有的誘變劑是作用于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，就要選對(duì)數(shù)期的細(xì)胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。 5．要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來(lái)作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 3． 每次誘變處理都有一定提高的菌株 ， 往往多次誘變能積累較多的提高 。 二、誘變育種步驟 ?出發(fā)菌株的選擇 ?處理菌懸液的制備 ?誘變處理 ?中間培養(yǎng) ?分離和篩選 (一 )出發(fā)菌株的選擇 1． 自然界新分離的野生型菌株 ， 對(duì)誘變處理較敏感 ， 容易達(dá)到好的效果 。 電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑 ， 它能造成不可回復(fù)的缺突變 。 3． 吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷 。 2． 亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣 ， 造成的遺傳損傷較多 。 大部分誘變劑是致癌劑 ， 所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎 ， 要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸 ，且切勿吸入其蒸氣 ， 有人對(duì)某些誘變劑極其敏感 ， 甚至未直接接觸就會(huì)過(guò)敏 ， 這就更要當(dāng)心 。 而用電離輻射 177。 使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點(diǎn)： 大多數(shù)情況下 ， 就突變數(shù)量而言 ， 要比電離輻射更有效 。 化學(xué)誘變劑： 化學(xué)因子如堿基類似物 、 5— 氟尿嘧啶 、 烷化劑等 。 許多高產(chǎn)菌株的選育都用過(guò)紫外線 ，對(duì)于一般實(shí)驗(yàn)室 、 中小型工廠都適用 ， 也很安全 。 ? 誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種 ， 是迄今為止國(guó)內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量 、 性能的主要手段 。 ? c. 賦予菌種對(duì)多種底物 ， 特別是價(jià)廉而豐富的底物的利用能力 ， 由此可降低操作費(fèi)用 。 改進(jìn)菌種的生長(zhǎng)效率 ? 提高菌株對(duì)底物的利用率方法： ? a. 通過(guò)確定并改變代謝中的耗能部分 。 提高特定基因的表達(dá)水平 ? (1)引入強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào) ， 可通過(guò)在一高效表達(dá)載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強(qiáng)啟動(dòng)子；修改現(xiàn)有表達(dá)信號(hào) ， 提高基因效力等 。 (6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制 。 (4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶 。 (2)增加前體物的濃度 。 ? 如果對(duì)特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少 ，則多半采用隨機(jī)誘變 、 篩選及選育等技術(shù)： ? 如果對(duì)其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認(rèn)識(shí) ， 則可選擇基因重組等手段進(jìn)行定向育種 。 ? (3)改良菌種的評(píng)價(jià) (包括實(shí)驗(yàn)規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模 )。 工業(yè)菌種育種的方法 ? 誘變 ? 基因轉(zhuǎn)移 ? 基因重組 育種過(guò)程 ? 包括下列 3個(gè)步驟： ? (1)在不影響菌種活力的前提下 ， 有益基因型的引入 。 第三節(jié) 工業(yè)菌種的育種方針 ? 工業(yè)菌種的育種： 是運(yùn)用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對(duì)某個(gè)用于特定生物技術(shù)目的的菌株進(jìn)行的多方位的改造 。 七、生產(chǎn)選種 ? 是在長(zhǎng)年累月的生產(chǎn)實(shí)踐中 ， 在培養(yǎng)工藝條件沒(méi)有任何可見(jiàn)變更情況下 ， 突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大 ， 這就有可能是個(gè)別自然變異朝更好的方向變的細(xì)胞 ， 在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件 ， 并逐漸顯示出它的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì) ， 這種優(yōu)勢(shì)的發(fā)展 ， 促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露 。 餌誘技術(shù)常用于水中真菌的富集 。 ? 植物材料中真菌的分離：植入法 ， 壓貼法 ， 洗滌法 ， 浸泡法 。在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗