【正文】 胞的過程 。 轉(zhuǎn)化時(shí) ， 細(xì)菌必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源 DNA的狀態(tài) ，然后利用短暫熱休克使 DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主中 。 ? 此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌 ， 它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便 、 轉(zhuǎn)化效率高 、 適用于任何菌株 。 二、轉(zhuǎn)染和感染 ? 利用噬菌體 DNA作為載體時(shí)可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌 。 一種是感染 ， 即在體外將噬菌體 DNA包裝成病毒顆粒 ， 然后使其感染受體菌 。 另一種方式是轉(zhuǎn)染 ， 即在 DNA連接酶作用下使噬菌體 DNA環(huán)化 ， 再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌 。 但習(xí)慣上常把以噬菌體 DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染 。 重組克隆的篩選與鑒定 ? 基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落 ， 并鑒定重組子的正確性 。 ? 通過細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴(kuò)增 ， 獲得所需的基因片段的大量拷貝 。 進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu) 、 功能 ， 或表達(dá)該基因的產(chǎn)物 。 一、抗藥性標(biāo)志的篩選 ? 如果克隆載體帶有某種抗藥性標(biāo)志基因如 ampr或 tetrr ， 轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落 ，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來 。 如果重組 DNA時(shí)將外源基因插入標(biāo)志基因內(nèi) ， 該標(biāo)志基因失活 ， 通過有無抗菌素培養(yǎng)基對比培養(yǎng) ， 還可區(qū)分單純載體或重組載體 （ 含外源基因 ） 的轉(zhuǎn)化菌落 。 二、 β －半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選 ? 很多載體都攜帶一段細(xì)菌的 lacZ基因 ， 它編碼 β －半乳糖苷酶 N端的 146個(gè)氨基酸 ， 稱為 α－肽 ， 它表達(dá) β －半乳糖苷酶的 C端肽鏈 。 ? 當(dāng)載體與宿主細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩個(gè)片段時(shí) ， 宿主細(xì)胞才有 β －半乳糖苷酶活性 ， 使特異的底物Xgal 變?yōu)樘m色化合物 ， 這就是所謂的 α －互補(bǔ) 。 ? 而重組子由于基因插入使 α －肽基因失活 ， 不能形成 α －互補(bǔ) ， 在含 Xgal的平板上 ， 含陽性重組子的細(xì)菌為無色菌落或噬菌斑 。 ? 三 、 菌落快速裂解鑒定法 ? 從平板上直接挑選菌落裂解后 ， 直接電泳檢測載體質(zhì)粒大小 ， 判斷有無插入片段存在 ， 該法適于插入片段較大的重組子初篩 。 ? 四 、 內(nèi)切酶圖譜鑒定 ? 經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落 ， 小量培養(yǎng)后 ， 再分離出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體 DNA， 用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割 ， 釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入的重組子 ， 還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入的方向 。 重組 DNA的鑒定 遺傳學(xué)方法 第七節(jié) 雜交育種 (一 )細(xì)菌雜交 ? 在細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)雜交的種類尚不多 ， 主要是大腸桿菌 ， 其他還有鼠傷寒沙門氏菌 、 銅綠假單胞菌 、淋病奈氏球菌等 。 ? 大腸桿菌中存著致育因子 F， 有 F因子為 F+， 沒有F因子稱 F。 ? F因子存在于細(xì)胞中形式：游離狀態(tài) (F+細(xì)胞 )；整合狀態(tài) ， 即 F因子插入胞核質(zhì)的一定位置上(Hfr細(xì)胞 )。 ? F因子有明顯的感染性 ， 大腸桿菌的接合 ， 實(shí)質(zhì)上是 F因子的轉(zhuǎn)移 ， 所以 F+和 Hfr稱供體菌 ， 而 F稱受體菌 。 （ 二）酵母雜交育種技術(shù) ? 酵母繁殖方式 ? 酵母為單細(xì)胞型真菌 ， 一般以出芽方式生殖 ， 在通常情況下 ， 繁殖體為雙倍體 ， 但經(jīng)過特定條件的誘導(dǎo) ， 可使其產(chǎn)生單倍體孢子并可出芽產(chǎn)生單倍體繁殖體 。 ? 單倍體細(xì)胞具 α 及 ε 2兩種交配型 。 兩種交配型細(xì)胞經(jīng)其細(xì)胞壁上特定的凝聚因子誘導(dǎo)而進(jìn)行交配 ， 恢復(fù)為雙倍體；同一交配型細(xì)胞之間 ， 則因細(xì)胞壁上凝集因子的存在而不能進(jìn)行交配 。 ? 在生活過程中 ， 酵母細(xì)胞還可以形成三倍體 、 四倍體 、 多倍體或非整倍體細(xì)胞 。 ? 酵母雜交 ? 一般而言 ， 雜交育種運(yùn)用了酵母的單雙倍生活周期 ， 將不同基因型和相對的交配型的單倍體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細(xì)胞 ， 經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀 。 ? 酵母的雜交方法有孢子雜交法 、 群體交配法 、單倍體細(xì)胞雜交法和罕見交配法 。 就啤酒酵母而言 ， 運(yùn)用罕見交配法更易獲得結(jié)果 。 第八節(jié) 原生質(zhì)體育種 ? 原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合 、 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù) ， 此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等 。 ? 原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法 。 ? 原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會(huì)上提出來的 。 一、原生質(zhì)體融合育種的特點(diǎn) (一 )雜交頻率較高：細(xì)胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體 。 (二 )受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用 ， 因此有利于不同種屬間微生物的雜交 。 (三 )遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似的合二為一的過程 。 (四 )存在著兩株以上親株同時(shí)參與融合形成融合子的可能性 。 （ 五有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株 。 (六 )提高菌株產(chǎn)量的潛力較大 。 (七 )有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系 。 二、原生質(zhì)體融合育種步驟 1． 標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗(yàn)證 。 2． 原生質(zhì)體制備 。 3． 等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合 。 4． 涂布于再生培養(yǎng)基 ， 再生出菌落 。 5． 選擇性培養(yǎng)基上劃線生長 ， 分離驗(yàn)證 ， 挑取融合子進(jìn)一步試驗(yàn) 、 保藏 。 6． 生產(chǎn)性能篩選 。 三、原生質(zhì)體融合育種的要點(diǎn) （ 一 ） 標(biāo)記菌種的選擇 獲得標(biāo)記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種 ，篩選出營養(yǎng)缺陷型或／和抗藥性菌株 。 這里最重要的是標(biāo)記必須穩(wěn)定 。 采用抗藥性菌株除可作標(biāo)記外 ， 在實(shí)驗(yàn)室中還可排除雜菌污染的干擾 。 為的是確證融合的成功 ， 可以采用多標(biāo)記菌種 。 (二 )原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細(xì)胞壁分解酶 ， 將細(xì)胞壁分離剝離 ， 結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細(xì)胞 ， 它保持原細(xì)胞的一切活性 。 在放線菌和細(xì)菌中 ， 制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等 。 影響原生質(zhì)體制備的因素 1． 菌體的前處理 為了使酶作用的效果好一些 ， 可將菌作一些前處理 。 如細(xì)菌加入亞抑制劑量的青霉素 。 2． 菌體的培養(yǎng)時(shí)間 為了使細(xì)胞易于原生質(zhì)體化 ， 一般選擇增殖期的菌體 。 3 ． 酶濃度 對于不同種屬的微生物 ， 不僅對酶的種類要求不同 ， 就是對酶的濃度也有差異 。 另外 ， 最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化 。 ? 4．酶處理溫度 ? 5．破壁時(shí)的 pH值 ? 6．滲透壓穩(wěn)定劑 等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機(jī)物和 KCl和 NaCl等無機(jī)物。 第九節(jié) 篩選新的代謝產(chǎn)物 一、開發(fā)新的代謝產(chǎn)物的途徑 ? (1)從自然界分離新的微生物菌株，或采用新的檢閱方法篩選新的代謝產(chǎn)物。 ? (2)對已知微生物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)修飾。 ? (3)利用微生物轉(zhuǎn)化改造代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。 (4)通過原生質(zhì)體融合獲得新的代謝產(chǎn)物。 ? (5)DNA重組技術(shù)。 二、篩選微生物新的代謝產(chǎn)物 的程序 突變型菌株的篩選 ? 一、產(chǎn)量性狀突變株的篩選 三、篩選微生物代謝產(chǎn)物的目標(biāo) ? 篩選克服抗生素抗性菌株的活性物質(zhì)； ? 篩選抗腫瘤 、 抗病毒的活性物質(zhì)； ? 研究有藥理活性的酶抑制劑及免疫調(diào)節(jié)劑； ? 尋找食品工業(yè)最好的酵母培養(yǎng)物； ? 篩選降解有害物質(zhì)的微生物以及治療上具有低毒 、 長效的化學(xué)藥物等 。 四、篩選微生物代謝產(chǎn)物的方法 ? (一 )直接方法 ? 為了盡快確定微生物代謝產(chǎn)物的利用前途 ， 在體外試驗(yàn)測得活性后 ， 可以將培養(yǎng)液的有效成分直接作用于機(jī)體 ， 觀察被測樣品的療效 。 ? 這種直接確定代謝產(chǎn)物用途的方法亦稱動(dòng)物體內(nèi)治療試驗(yàn) 。 ? (二 )間接方法 ? 篩選醫(yī)用抗生素 ， 可用細(xì)茵 、 真菌 、 病毒或腫瘤模型 ， 尋找抗細(xì)菌 、 抗真菌 、 抗病毒 、 抗腫瘤抗生素 、 酶抑制劑 、 免疫制劑等有效物質(zhì) 。 ? 在預(yù)篩選時(shí) ， 多用瓊脂平扳擴(kuò)散抑菌法 。 通過預(yù)篩選 ， 直接測定最初分離物的生物活性 ， 能加速篩選過程 。 五、檢測系統(tǒng) ? 篩選過程的成功依賴于排除那些已知的或并非需要的代謝產(chǎn)物的檢驗(yàn)方法 ， 這樣才能識別出人們需要的化合物 。 性能簽別 ? 性能鑒別是分離和篩選微生物代謝產(chǎn)物中最基礎(chǔ)的工作 。 ? 鑒別可分為兩方面： 一是對微生物方面進(jìn)行形態(tài) 、 培養(yǎng) 、 生化功能答試驗(yàn)觀察 ， 并確定微生物產(chǎn)生菌的類群； ? 二是從化學(xué)的早期鑒別來鑒別微生物的代謝產(chǎn)物 。 化學(xué)的早期鑒別一般對產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行紙上層析 、 薄板層析 、 紙上電泳 、 抗茵譜 、 高壓電泳 、 紫外分光光度法 、 液相和氣相色譜等試驗(yàn) ， 井獲得各種圖譜 ， 與已知圖譜進(jìn)行比較鑒別 。 ? 如果認(rèn)為是有實(shí)用前途的代謝產(chǎn)物 ， 則要進(jìn)一步大量培養(yǎng) ， 并進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn) 、 毒性考查 、 藥物代謝等實(shí)驗(yàn) ， 并進(jìn)行提高發(fā)酵水平和改善提取工藝的工作 ， 以備投入生產(chǎn) 。 ? 如果是新的代謝產(chǎn)物 ． 一般要進(jìn)一步確定其化學(xué)結(jié)構(gòu) ， 井在此基礎(chǔ)上進(jìn)行合成法的研究或進(jìn)行化學(xué)改造 ， 研究結(jié)構(gòu)與生物活性的相互關(guān)系 ，并對作用機(jī)制 、 生物合成過程作進(jìn)一步的研究 。 菌種篩選方法 ? 誘變處理后，突變細(xì)胞只占存活細(xì)胞的百分之幾，而能使生產(chǎn)狀況提高的細(xì)胞又只是突變細(xì)胞中的少數(shù)。 ? 為了花費(fèi)最少的工作量，在最短的時(shí)間內(nèi)取得最大的篩選成效，就要求采用效率較高的科學(xué)篩選方案和手段。 菌種篩選方案 ? 初篩：目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良菌種不致于漏網(wǎng)。初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次。初篩的手段應(yīng)盡可能快速、簡單。 ? 復(fù)篩的目的是確認(rèn)符合生產(chǎn)要求的菌株，所以，復(fù)篩步驟以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個(gè)菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。 菌種篩選的手段 ? 初篩 ? 從菌體形態(tài)變異分析 ? 平皿快速檢測法 具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等 ? 搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法也可用于初篩。 初篩的搖瓶培養(yǎng)一般是一個(gè)菌株只做一次發(fā)酵測定，從大量菌株中選出 1020%較好的菌株，淘汰8090%的菌株；而復(fù)篩中搖瓶培養(yǎng)一般是一個(gè)菌株培養(yǎng) 3瓶，選出 35個(gè)較好的菌株，再做進(jìn)一步比較，選出最佳的菌株 。 特殊變異菌的篩選方法 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 經(jīng)誘變處理后的菌懸液在篩選前一般應(yīng)先進(jìn)行誘變后培養(yǎng)，以促使變異細(xì)胞發(fā)生分離，防止出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，篩選出不純的菌株。營養(yǎng)缺陷型的篩選一般包括濃縮、進(jìn)一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。 ? 抗性突變菌株的篩選 抗性突變株的篩選相對比較容易，只要有 106頻率的突變體存在，就容易篩選出來?？剐酝蛔冎甑暮Y選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段。 一次性篩選法 噬菌體抗性菌株、耐高溫菌株 階梯性篩選法藥物抗性突變株。 ? 組成酶變異株的篩選 許多水解酶是誘導(dǎo)酶，只有在含有底物或底物類似物的培養(yǎng)環(huán)境中，微生物才會(huì)合成這些酶類，所以，誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)不僅需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物的種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物的影響。 具體的篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導(dǎo)抑制物法。 ? 1) 恒化器法：常被用于微生物的“馴化”。在培養(yǎng)基中添加不能起誘導(dǎo)作用的低濃度底物，菌生長速率極慢，而群體中少數(shù)組成型變異株則可合成有關(guān)的酶，分解利用該底物，生長速率較快。