【正文】 生素即可有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及菌落形成。 富集可以是種水平的，如通過營(yíng)養(yǎng)要求的改變來富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。 有時(shí) ， 真菌子實(shí)體形成必須有光線 ， 這在分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加以考慮 。 這里主要是利用營(yíng)養(yǎng)成分的減少而使生長(zhǎng)減慢 ， 并由此限制真菌的遷涉生長(zhǎng) 。 ? 將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取 ， 點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng) ， 以進(jìn)一步篩選和分離 。 ? 通過高倍放大進(jìn)行鏡檢 ， 可了解氣生和營(yíng)養(yǎng)孢子形成情況 。 ? 水中放線菌的分離： 為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或?yàn)V紙過濾，取離心沉積或?yàn)V紙表面沉積進(jìn)行系列稀釋和涂布。 ? 植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細(xì)菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。 ? 分離瓊脂平板制備好后 ， 一般皆應(yīng)在 37℃ 培養(yǎng)箱中存放 3天 。 ? 在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮 ， 以抑制真菌的繁殖 。 （三）培養(yǎng)基的組成原則 ? 大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的 。 ? 樣本采集完后 ， 應(yīng)及時(shí)處理或在 4℃ 下貯存 ，貯存試樣處應(yīng)與劃線 ， 篩選平板分開 ， 貯存時(shí)間不宜過長(zhǎng) 。 五、放線菌的分離 ? (一 )采樣及采集方法 ? 應(yīng)盡可能實(shí)行無菌操作。 篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后 ， 按生長(zhǎng)出菌落的形態(tài)學(xué)特征如色素 、 菌落形態(tài)等進(jìn)行最初分組 。 次代培養(yǎng)及純化步驟 涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后 ， 如生長(zhǎng)出菌落 ， 則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對(duì)瓊脂平板進(jìn)行分類 。 ? 另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細(xì)菌 “ 附著材料 ” ， 如無菌的植物組織或土壤浸出液 。 水中細(xì)菌分離的簡(jiǎn)易富集技術(shù) ? 在無菌的 、 用棉團(tuán)塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng) ， 定期取樣涂布適宜分離瓊脂平板上； ? 在不同水體的水樣中加入一定的底物如蔗糖 、 多糖及蛋白質(zhì)等 ， 同樣可以促進(jìn)水中微生物的增殖 。 ? 水中細(xì)菌的分離：水樣通過 ，取出濾膜用 1ml無菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。 ? 土樣中細(xì)菌的富集：適度稀釋后，取 添加及未添加富集底物 (如幾丁質(zhì)、纖維素等 )的土浸出汁平板。 富集方法 ? 運(yùn)用細(xì)菌的酶誘導(dǎo)性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復(fù)雜底物及生長(zhǎng)因子的前體物質(zhì)來激活細(xì)菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術(shù)。 土中細(xì)菌的富集培養(yǎng)與分離 ? 分離土樣中的大部分細(xì)菌的分離程序中無需進(jìn)行富集。 瓊脂平板在使用前應(yīng)置于 37℃ 培養(yǎng)箱中孵育 l、2天。 加入培養(yǎng)基中的天然提取物 ， 部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳 、 氮源 ，如幾丁質(zhì) 、 纖維素或果膠 。 (二 )生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基 的組成原則 加入培養(yǎng)基中的天然提取物種類和用量 、 環(huán)境生物物理學(xué)參數(shù)以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)中所要分離的細(xì)菌的數(shù)量和種類 。 水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶 。 如果有急流存在的話 ， 應(yīng)直接將瓶口反向于急流 。 ? 由于表層水中含有泥沙 ， 故在采樣時(shí)應(yīng)在較深的靜水層中采集水樣 。 將洗凈的根裝入采樣袋中 ， 采集根系時(shí) ，一般與根際土樣一起保存 。 ? 選擇葉面時(shí)應(yīng)考慮葉位 、 葉齡 、 葉片正反面和在一片葉上的取樣部位 。 ? 在采集植物根際土樣時(shí) ， 一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根 ， 在大量無菌水中浸漬約 20min， 洗去粘附在根上的土壤 ， 然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土 ， 這部分上卻為根際土樣 。 如果層次要求不嚴(yán)格 ， 可取離地面 5～15cm處的土 。 采樣的注意事項(xiàng) 采樣時(shí)應(yīng)盡可能保持相對(duì)無菌； 所采集的樣本必須具有某種代表性； 采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類及采集日期 、 地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理 、 生態(tài)參數(shù)等； 應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時(shí)間因素 ， 因?yàn)檎嬲脑鼐旱某霈F(xiàn)可能是短暫的； ? 采好的樣應(yīng)及時(shí)處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于 4℃ 下，但貯存時(shí)間不宜過長(zhǎng)。 四、自然界中細(xì)菌的分離 (一 )采樣和采集方法 ? 為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細(xì)菌菌群 ， 特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時(shí) ， 必須十分重視樣本的采集 。 選擇適宜的培養(yǎng)分離方法和檢測(cè)方法 。 一、成功的分離培養(yǎng)方法 (1)認(rèn)真考它所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過程； (2)制訂初步的篩選標(biāo)準(zhǔn)； (3)將生態(tài)學(xué)方法運(yùn)用到分離和篩選過程 。 ? 在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株；在工業(yè)微生物篩選過程中 ， 應(yīng)及時(shí)調(diào)整檢測(cè)方法 ， 以與各種不同類型的生長(zhǎng)和代謝之微生物相適應(yīng) 。 第二節(jié) 培養(yǎng)分離 ? 從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟 。 ： ； :； ： （五）毒性試驗(yàn) ? 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的 ，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心 ， 尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種 ， 更應(yīng)慎重 。 純種分離的方法有劃線分離法 、 稀釋分離法 。 因此還必須分離 ， 純化 。 這樣對(duì)下階段的純種分離就會(huì)順利得多 。 ： ； :； ： （二）增殖培養(yǎng) ? 為了容易分離到所需的菌種 ， 讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加 ， 可以通過配制選擇性培養(yǎng)基 ， 選擇一定的培養(yǎng)條件來控制 。 ? 采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后 ， 用小薩子除去表土 ， 取離地面 515cm處的土約 10g， 盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中 ， 扎好 ， 標(biāo)記 ， 記錄采樣時(shí)間 、 地點(diǎn) 、 環(huán)境條件等 ， 以備查考 。 采樣的對(duì)象也可以是植物 ， 腐敗物品 ， 某些水域等 。 三、新種分離與篩選的步驟 （ 一）采樣 采樣對(duì)象 以采集土壤為主 。 ? 發(fā)酵性能測(cè)定： 進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定 。 ? 增殖： 人為地通過控制養(yǎng)分或培條件 ， 使所需菌種增殖培養(yǎng)后 ， 在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì) 。 ? 定方案： 首先要查閱資料 ， 了解所需菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)特性 。 ? 實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌 ， 也必須重新進(jìn)行分離純化 。生產(chǎn)中常用菌種的分離、選育和保藏 ： ； :； ： 帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種 顯微觀察裝置 ： ； :； ： 第一節(jié) 菌種的分離簡(jiǎn)介 一、菌種的來源 ? 根據(jù)資料直接向有科研單位 、 高等院校 、 工廠或菌種保藏部門索取或購(gòu)買； ? 從大自然中分離篩選新的微生物菌種 。 二、分離思路 ? 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求 、 菌種的特性 ， 采用各種篩選方法 ，快速 、 準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來 。 ? 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。 ? 采樣： 有針對(duì)性地采集樣品 。 ? 分離： 利用分離技術(shù)得到純種 。 這些特性包括形態(tài) 、 培養(yǎng)特征 、 營(yíng)養(yǎng)要求 、 生理生化特性 、 發(fā)酵周期 、 產(chǎn)品品種和產(chǎn)量 、 耐受最高溫度 、 生長(zhǎng)和發(fā)酵最適溫度 、 最適 pH值 、 提取工藝等 。 一般園田土和耕作過的沼澤土中 ， 以細(xì)菌和放線菌為主 ，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中 ， 酵母和霉菌較多 ， 如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi) 。 ： ； :； ： 從自然界篩選 ? 采樣季節(jié)：以溫度適中 ， 雨量不多的秋初為好 。 為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化 ， 宜將樣品逐步分批寄回 ， 以便及時(shí)分離 。 ? 例如碳源利用的控制 ， 可選定糖 ， 淀粉 、 纖維素 ， 或者石油等 ， 以其中的一種為唯一碳源 ， 那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng) ，而其它微生物就可能死亡或淘汰 。 （三）培養(yǎng)分離 ? 盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著 ， 但還是處于微生物的混雜生長(zhǎng)狀態(tài) 。在這 — 步 ， 增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用 ， 而且控制得細(xì)一點(diǎn) ， 好一點(diǎn) 。 （四）篩 選 ? 這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 ， 通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn) ， 以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種 。 據(jù)有的國(guó)家規(guī)定 ，微生物中除啤酒酵母 、 脆壁酵母 、 黑曲霉 、 米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗(yàn)外 ，其他微生物作為食用 ， 均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn) 。 ? 到目前為止 ， 還沒有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個(gè)試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類 。 ? 因此 ， 建立一更為科學(xué)的和針對(duì)性不強(qiáng)的分離方法是必要的 。 二、培養(yǎng)分離中要解決的問題 “ 分離什么和從哪里分離出 ?” 必須充分考慮所分離微生物的生產(chǎn)能力 、 生長(zhǎng)速度 、 生物群體培養(yǎng)和產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及其提純的難易和費(fèi)用 ， 工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中穩(wěn)定性及遺傳操作的難易程度等 。 三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離的一般思路要點(diǎn) ? 1． 羅列出所要分離的微生物類群； ? 2． 根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù) ， 描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地： ? 3． 將若干樣本分成若干類型 ， 如植物和植物各部 ， 土壤 (類型和土層 )、 巖石 、 水 、 昆蟲和發(fā)酵食品等； ? 4． 羅列出所要考察和測(cè)量的環(huán)境參數(shù) ， 如 pH、鹽分 、 水分 、 氧化還原電勢(shì)及溫度等； 5．列出生物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質(zhì)、葡萄表皮的果膠； 6．根據(jù)上述 15項(xiàng)中所獲得的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養(yǎng)條件； 7．用標(biāo)準(zhǔn)方法作對(duì)照來評(píng)價(jià)生態(tài)學(xué)分離方法； 8．根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要，修改已知的方法； 9．運(yùn)用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類群。 ? 樣本采集時(shí)所需的工具通常有無菌刮鏟 、 土樣采集器 、 鑷子 、 解剖刀 、 手套 、 無菌小塑料袋和塑料瓶等 。這是因?yàn)橐坏┎蓸咏Y(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會(huì)發(fā)生變化，微生物群體之間就會(huì)出現(xiàn)消長(zhǎng) 1．土樣采集方法 ? 森林 、 旱地 ， 草地可先掘洞 ， 由土壤下層向上層順序采集； ? 水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集 。 將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中 。 2．植物體采集方法 ? 在采集葉面時(shí) ， 一般是用滅菌的剪刀 、 打孔器 、安全刀片等 ， 由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊 ， 并注意不要損傷周圍邊緣 。 ? 采集植物根及根系時(shí) ， 方法與根際土樣采集方法相似 。 3．水樣采集方法 ? 用于細(xì)菌檢測(cè)的水樣應(yīng)收集于 100m1干凈 、 滅菌的廣口塑料瓶中 。 ? 方法是：握住采樣瓶底浸入水中 3050cm處 ， 然后瓶口朝下打開瓶蓋 ， 讓水樣進(jìn)入 。 采集瓶從水中取出時(shí)應(yīng)迅速并帶有較大的弧度 。 所有水樣都應(yīng)在 24h之內(nèi)迅速進(jìn)行檢測(cè) ，或者 4℃ 下貯存 。 就分離培養(yǎng)基的組成而言 ， 部分培養(yǎng)基中必須含有 1050%的天然提取物 。 所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑 (如放線菌酮和制霉素 )，摻加濃度一般為 50μg／ m1， 以抑制真菌的生長(zhǎng)。 培養(yǎng)基的生物物理學(xué)參數(shù)，如 pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。 ? 但對(duì)某些少數(shù)細(xì)菌則要求特殊的富集或選擇技術(shù)才能很好地被分離培養(yǎng) 。 ? 富集可以促進(jìn)抗性的產(chǎn)生并維持下來。 ? 植物體上細(xì)菌的分離：無菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取 1ml經(jīng)適度稀釋后涂布平板。用樣本稀釋液適度稀釋 ,涂布平板倒置培養(yǎng)或?yàn)V紙壓印分離法。 ? 培養(yǎng)過程中可加入低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長(zhǎng) 。 ? 通過改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細(xì)菌 、 中溫菌和嗜高溫菌 。 用無菌牙簽將菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板上及轉(zhuǎn)接