【正文】 ? 為了提高組成酶變異株的優(yōu)勢(shì)，即它在群體中的比例，可以應(yīng)用恒化器培養(yǎng)技術(shù)。隨著恒化器培養(yǎng)中不斷加入新鮮基質(zhì)而逐漸增大組成酶變異株的優(yōu)勢(shì)，這樣就能夠比較容易地做進(jìn)一步的純化分離。 ? 2) 循環(huán)培養(yǎng)法：利用不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。 ? 當(dāng)接種到不含誘導(dǎo)物而含有其它可利用碳源的培養(yǎng)基中時(shí)，兩種類型菌株同樣能較好地生長(zhǎng)，但在此環(huán)境中組成型突變株已能合成有關(guān)的水解酶，而誘導(dǎo)型菌株就不能合成。 ? 將它們轉(zhuǎn)接入含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中時(shí)，變異株能迅速利用誘導(dǎo)底物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，而誘導(dǎo)型出發(fā)菌株需經(jīng)歷一個(gè)誘導(dǎo)合成酶的階段，兩類菌株的生長(zhǎng)就不同步，組成酶變異株所占的比例將逐漸增大。 ? 3) 誘導(dǎo)抑制劑法：有些化合物能阻止某些誘導(dǎo)酶的合成，當(dāng)在誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)抑制劑同時(shí)存在的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)待分離菌群時(shí)，誘導(dǎo)型菌株不能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，無法正常生長(zhǎng)，只有組成型變異株能夠利用底物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。 第十節(jié) 工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù) ? 在生產(chǎn)發(fā)酵中 ， 具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存和長(zhǎng)期保藏 ， 對(duì)于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要 。 一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件 (1) 經(jīng)長(zhǎng)期保藏后菌種存活健在； (2) 保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型 ， 特別是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力 。 (3)菌種保藏的基本措施是低溫 、 干燥 、 真空 。 二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù) (1)冷凍干燥或真空干燥保藏； (2)超低溫或在液氮中冷凍保藏； (3) 轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀? (4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。 冷凍保藏 ? 冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡(jiǎn)單而有效的方法 。 ? 通過冷凍 ， 使微生物代謝活動(dòng)停止 。 一般而言 ，冷凍溫度愈低 ， 效果愈好 。 為了獲得滿意的冷凍結(jié)果 ， 通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑 。 冷凍保藏時(shí)溫度要求在 20℃ 以下 ， 同時(shí)應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變 。 ? 冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難 。 冷凍保藏種類 一 、 普通冷凍保藏技術(shù) (20℃ ) 二 、 超低溫冷凍保藏技術(shù) (60一 80℃ ) 三 、 液氮冷凍保藏技術(shù) 普通冷凍保藏技術(shù) (20℃) ? 將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉 ， 然后貯藏于一冰箱的冷藏室中 ，或于溫度范圍在 5～ 20℃ 的普通冰箱 (20℃ )中 ?；蛘?， 將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上 ， 待生長(zhǎng)適度后 ， 將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好 ， 同上置于冰箱中保存 。 ? 用此方法可以維持若干微生物的活力 1— 2年 。 ? 應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏 。 ? 保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度 ， 培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封 。 ? 這一方法雖簡(jiǎn)便易行 ， 但不適宜多數(shù)微生物的長(zhǎng)期保藏 。 二、超低溫冷凍保藏技術(shù) (60一 80℃) ? 要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種 ， 一般都要求在 60℃ 以下進(jìn)行保藏 。 ? 在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是： ? 1． 離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞； ? 2． 用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞； ? 3． 加入等體積的 20％ 甘油或 10％ 二甲亞砜； ? 4． 混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中 ， 于 70℃ 超低溫冰箱中保藏 。 ? ? 如果待保藏菌種生長(zhǎng)在斜面上，則可用含 10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在 12℃ ／ min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏 5年而活力不受影響。 三、液氮冷凍保藏技術(shù) (一 )冷凍保護(hù)劑 在液氮冷凍保藏中 ， 最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油 ， 最終使用濃度一般為甘油 10％ 、 二甲亞砜 5％ 。 所使用的甘油 — 般用高壓蒸汽滅菌 ， 而二甲亞砜最好為過濾滅菌 。 (二 )液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟 1．待冷凍保藏菌種懸液的制備 (1)從生長(zhǎng)斜面制備菌懸液：每一斜面加入 5ml含10％甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液； ～ lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶， (2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液： 在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積 20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散； 氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于 5℃ 冰箱中 3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。 2． 控速冷凍 ． (1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中 ， 然后置于一較大的金屬容器中； (2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中； (3)以 12℃ /min的致冷速度降溫 ， 直到溫度達(dá)到相對(duì)溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn) (通常為 30℃ )； (4)補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中 ， 使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生相變； (5)細(xì)胞凍結(jié)后 ， 將致冷速度降為 1℃ /min， 直到溫度達(dá) 50℃ ； (6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相 ()96℃ )或 氣相 (156℃ )中保存 。 如果無控速冷凍機(jī) ， 則一般可將安瓿或液氮瓶置于一 70℃ 冰箱中冷凍 4h， 然后迅速移入液氮罐中保存 。 (三 )復(fù)蘇 1． 從液氮罐中取出所需的安瓿 ， 立即置于冰浴中； 2． 迅速將安瓿置于 3740℃ 水浴中 ， 并輕輕搖動(dòng)以加速解； 3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取 (約 8滴 )轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。 凍干保藏 ? 冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華 ， 使培養(yǎng)物干燥 。此法是微生物菌種長(zhǎng)期保藏的最為有效的方法之一 。 ? 冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護(hù)劑 ， 目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖 ， 國外尚有運(yùn)用動(dòng)物血清等的 。 ? 大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏 10年之久而不喪失活力 。 而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏 ， 便于運(yùn)輸 。 培養(yǎng)物的凍干過程 (二 )操作步驟 1． 啟動(dòng)冷凍干燥器的致冷單元 。 當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到 40℃ 時(shí)啟動(dòng)真空泵 ， 使真空度達(dá)到 ～。 2． 將冷凍槽置于歧管之下方 。 槽中裝入 2／ 3體積的異丙醇 ， 然后插入溫度計(jì)及可調(diào)溫控儀降溫探頭 ． 打開降溫探頭控制醇浴溫度在 40℃ ， 這 — 過程約需 30min。 3． 每支斜面加入 2ml 20％ 的脫脂乳 ， 然后用巴氏吸管將斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌體均懸液 ，最終菌株濃度一般要求在 106CFU／ m1． 用細(xì)菌浸沒培養(yǎng)物來保藏時(shí) ， 加入 40％ 的脫脂乳 ， 混合制成含106CFU／ ml的均懸液 。 4． 取下安瓿上的棉塞 ， 然后用 lml移液管分裝安瓿 (／瓿 )， 重新塞好棉塞 。 5． 輕輕振蕩安瓿 ， 以使細(xì)胞重新懸浮 。 將安瓿與歧管相聯(lián)后迅速置于醇浴中 ， 然后調(diào)節(jié)溫控裝置 。 使細(xì)胞懸液迅速凍結(jié) 。 6． 15min后，將歧管與真空泵相通。 7． 維持 40℃ 的醇浴溫度 90120min， 然后調(diào)節(jié)溫控裝置 。 使醇浴溫度上升至 10℃ ， 維持 2h。 8． 關(guān)掉可調(diào)溫控裝置的降溫探頭 ， 讓醇浴溫度上升至室溫 (25℃ )． 9． 在冷凍干燥的最初 4h內(nèi)應(yīng)定期測(cè)真空度 ， 在安瓿置于真空下后 1h內(nèi) ， 真空度必須達(dá)到 ，并于菌懸液接近干燥時(shí)逐漸降到 ～ 。 10 ． 在真空狀態(tài)下 ， 讓安瓿保存在冷凍干燥機(jī) 中至少 16h以獲得完全干燥 。 11． 干燥后 ， 在 ～ ． 12． 在所有安瓿都封蓋好后 ， 撤去真空 。 13． 關(guān)閉真空泵 。 14． 關(guān)閉冷凝器 。 (三 )凍干菌種的保藏與再生 1． 保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于 5℃ 下保藏 。較低的保藏溫度 (20～ 70℃ )對(duì)于培養(yǎng)物的長(zhǎng)期穩(wěn)定更好 。 2． 復(fù)蘇： (1)在超凈工作臺(tái)中用 70％ 酒精棉球擦洗安瓿 ， 然后用砂輪在安瓿中銼一道溝 。 (2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿 ， 然后用手掰開安瓿 ． (3)在安瓿中加入 ～ 1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基 ， 慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿 ， 使凍干菌種復(fù)水 。 然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中 ， 或直接接種瓊脂斜面或涂布平板 。 (4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀 ， 可以將此直接振落入盛有 l～ 2ml液體培養(yǎng)基的試管中 ，輕輕振蕩 5～ l0min， 然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基 。 其他保藏方法 一、傳代保藏 二、礦物油中浸沒保藏 一、傳代保藏 ? 將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代 ， 然后在一定的生長(zhǎng)溫度下生長(zhǎng)和保存的傳代保藏方法 。 ? 可用于實(shí)驗(yàn)室中若干菌種的保藏 。 ? 此法最為簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì) ， 且不要求任何特殊的設(shè)備 。 ? 但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯 、 菌體自溶 、 基因突變 。 ? 因此要求在基本培養(yǎng)基上傳代為好 ， 目的是能淘汰突變株；同時(shí)轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平 。 ? 斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于 5℃ 保藏 ， 以防止培養(yǎng)基脫水并能降低代謝活性 。 ? 此方法一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長(zhǎng)期保藏方法 。 二、礦物油中浸沒保藏 ? 將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏 ， 此方法簡(jiǎn)便有效 。 ? 可用于絲狀真菌 、 酵母 、 細(xì)菌和放線菌的保藏 。 特別對(duì)難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效 。 ? 浸沒保藏的操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長(zhǎng) ， 然后注入經(jīng) 170℃ 下滅菌 12h的礦物油 ， 礦物油的用量以高出培養(yǎng)物 1cm為宜 。 ? 以液體石蠟作為保藏方法時(shí) ， 應(yīng)對(duì)需保藏的菌株預(yù)先作試驗(yàn) 。 因?yàn)槟承┚暝谝后w石蠟下生長(zhǎng)還十分明顯 ， 有些菌株如某些假絲酵母還會(huì)同化液體石蠟 ， 也有的對(duì)液體石蠟保藏敏感 。 所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏 。 為了預(yù)防不測(cè) ， 一般保藏株 2～ 3年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn) 。 不同菌種保藏方法比較 基因工程菌的保藏 ? 由載體質(zhì)粒等攜帶的外源 DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的 、 且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子 。 質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷?xì)胞生長(zhǎng)非必需 。 ? 一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí) ， 生長(zhǎng)速度會(huì)加快 。 ? 當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí) ， 抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長(zhǎng)選擇壓 。 而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí) ， 抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào) 。 ? 我們建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中 。 微生物活力和穩(wěn)定性測(cè)定 ? 所有保藏菌種的方法都必須是長(zhǎng)期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變 。 ? 在保藏時(shí)定期檢測(cè)菌種活力 ， 以確定保藏培養(yǎng)物的保藏期限和保藏方法的可靠性 ， 以及確定在實(shí)際保藏過程中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性 。 ? 對(duì)工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來說 ， 建議保藏菌種的形態(tài)學(xué)和生化特征 (如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生 、 酶活力 、 遺傳特征及生化指標(biāo) )應(yīng)在保藏后加以檢測(cè)和確定 。 ? 加速保藏試驗(yàn)可用于預(yù)測(cè)保藏過程中保藏培養(yǎng)物的穩(wěn)定性 。 在一給定溫度下通過對(duì)高溫下短期活力喪失程度檢測(cè) ， 可以用來預(yù)測(cè)嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定性 。 ? 成功的菌種長(zhǎng)期保藏方法之有價(jià)值的指標(biāo)包括在保藏 6個(gè)月 、 1年或更長(zhǎng)時(shí)間后存活百分率 (或存活單位 )。 細(xì)胞群體的形態(tài)學(xué)特征或一些特別的生化特征應(yīng)在菌種保藏前后保持同一性 ， 以及實(shí)驗(yàn)室中 、 中試車間中和生產(chǎn)發(fā)酵中產(chǎn)品滴度的穩(wěn)定性 ， 后者極為重要 。