【文章內(nèi)容簡介】 其孢子濃度可達(dá) l06個／ ml， 此為待處理孢子懸液 。 2． MNNG溶液的制備 用分析天平稱取 2mg， 加入 2ml ／ L pH ， 于暗處振蕩溶解 。 3．誘變處理 吸取 MNNG溶液 lml，加入到 1m1孢子懸液中， 30℃ 振蕩 30min，立即稀釋 1000倍停止作用，然后以 102， 104兩個稀釋度分離培養(yǎng)，30℃ 3天后計(jì)數(shù)。 4．死亡率計(jì)算 將未處理的孢子液 1ml加入 1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離， 30℃ 下培養(yǎng) 3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡率。 5．挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選． 第五節(jié) 營養(yǎng)缺陷型的選育 ? 營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸 、 維生素和堿基等的能力 ，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株 。 ? 與營養(yǎng)缺陷型對應(yīng)的是野生型 。 ? 能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基 (MM)； ? 在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分的稱補(bǔ)充培養(yǎng)基 (SM)； ? 能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基(CM)， 如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 、 麥芽汁培養(yǎng)基等 。 營養(yǎng)缺陷型的用途 ? 營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大 。目前生產(chǎn)氨基酸 、 核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型 。 要研究代謝途徑 ， 育種技術(shù)都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料 。 篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟 ? 誘變 ? 淘汰野生型 ? 檢出缺陷型 ? 確定生長譜 一、誘變方法 ? 物理誘變 ? 化學(xué)誘變 二、淘汰野生型 ? 抗生素法：野生型能在 MM中生長 ， 而缺陷型不能 ， 于是將誘變處理液在 MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長 ， 處于活化階段 ， 而缺陷型無法生長 ， 仍處于休眠狀態(tài) 。 由于細(xì)菌或酵母對一些抗生素敏感 ， 于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素 ，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死 ， 保存了缺陷型 。 一般細(xì)菌可以采用青霉素 ， 酵母可采用制霉菌素 。 ? 菌絲過濾法：對于霉菌 ， 因孢子生長后會長出菌絲體 ， 就可用濾紙過濾法將菌絲濾去 ， 而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過 。 三、檢出缺陷型 ? 原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上 ， 生長情況完全不同 ， 缺陷型在 CM上生長良好 ，而在 MM上則不生長 ， 野生型都能生長 。 ? 具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法 ? 1． 將一較平皿直徑小 1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨 ， 用金屬夾夾住 ， 滅菌 。 ? 2． 將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓 ， 使之成為印模 ， 標(biāo)記方位 。 ? 3． 將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓 ， 此菌印模即復(fù)印于上 。 (一 )影印法 ? 4 ． 將 CM和 MM在恒溫箱中培養(yǎng) 。 ? 5． 二平皿相同方位進(jìn)行比較 ， 即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長出的菌落少于 GM平板上的 。 MM上未長而相應(yīng)于 CM上長出的那幾個菌落就可能是缺陷型 。 ? 此法要求平皿上菌落不能太多 ， 菌落之間應(yīng)有一定間隔 。 (二 )點(diǎn)種法 ? 也就是任意法 。 ? 用接種針或牙簽將 CM上長出的菌落在 MM和CM兩副平板上接種 ， 依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種 ，然后一起培養(yǎng) ， 觀察其生長情況 。 ? 此法結(jié)果明確 ， 但工作量大 。 (三 )夾層法 ? 先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基 ， 凝固后涂上一層含菌的 MM， 凝固后再倒一薄層 MM瓊脂培養(yǎng)基 ， 培養(yǎng) 24h， 將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記 ，然后倒上一層 CM瓊脂培養(yǎng)基 ， 再培養(yǎng) 。 這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型 。 ? 此法缺點(diǎn)是 ， 結(jié)果有時不明確 ， 而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易 。 四、營養(yǎng)缺陷型生長譜的確定 ? 驗(yàn)證確定是缺陷型后 ， 就需確定其缺陷的因子 ， 即生長譜測定 。 生長譜測定的方法 ? 將缺陷型菌株培養(yǎng)后 ， 收集菌體 ， 制備成細(xì)胞懸液 ， 與 MM培養(yǎng)基 (融化并涼至 50℃ )混合并傾注平皿 。 待凝固后 ， 分別在平皿的 5～ 6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片 。 培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出 ， 就可測得所需營養(yǎng) 。 — 個平皿測一個菌 。 ? 以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至 50℃ 的 MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿 ， 然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應(yīng)位置 ， 培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子 。 在 5～ 6個平皿上可測 20株菌以上 。 第六節(jié) 基因育種 ? 基因重組育種：是運(yùn)用體外 DNA各種操作或修改手法獲得目的基因 ， 再借助于病毒 、 細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體 ， 將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá) ， 或者通過細(xì)胞間的相互作用 ， 使一個細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另 — 個細(xì)胞的方法 。 一個完整的基因克隆過程包括以下步驟 ? １ 、 獲得待克隆的 DNA片段 （ 基因 ） ； ? ２ 、 目的基因與載體在體外連接； ? ３ 、 重組 DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞； ? ４ 、 篩選 、 鑒定陽性重組子； ? ５ 、 重組子的擴(kuò)增與／或表達(dá) 。 基因重組 一、質(zhì)粒的特點(diǎn) 質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動必需 。 每個細(xì)胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù) 。不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異 ， 同一質(zhì)粒在不同條件下 ， 拷貝數(shù)也可能差異很大 ， 有嚴(yán)緊型和松弛型兩種 。 質(zhì)粒 DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見的一種是共價 、 閉環(huán)狀 DNA(CCC DNA)；其次是由于 —條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán) DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性 DNA。 質(zhì)粒載體 二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細(xì)胞的不同表現(xiàn)型 抗生素抗性：抗生素的產(chǎn)生；大腸桿菌素的產(chǎn)生；腸毒素的產(chǎn)生；復(fù)雜有機(jī)化合物的降解；限制性核酸內(nèi)切酶和修飾酶的產(chǎn)生；殺傷性能。 在自然條件下，許多質(zhì)?？山?jīng)細(xì)菌接合或相似方式在宿主間相互轉(zhuǎn)移。在實(shí)驗(yàn)室條件下，質(zhì)粒也可經(jīng)人工手段將其轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞內(nèi)。 三、質(zhì)粒 DNA的提取方法 ? 細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒擴(kuò)增； ? 細(xì)菌的收獲和裂解； ? 質(zhì)粒 DNA的提取 。 四、遺傳轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化是指受體細(xì)胞直接攝取供體細(xì)胞游離的DNA片段，將其同源部分進(jìn)行堿基配對，組合到自己的基因中，從而獲得供體細(xì)胞的某些遺傳性狀。 (二 )操作步驟： 質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 1．從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入 10ml肉湯培養(yǎng)基中， 37℃ 培養(yǎng)過夜。 2．取 50ml肉湯中，無菌添加 ／ LMgCl2，于 37℃ 振蕩培養(yǎng)。 3．將 ／ L CaCl2溶液、試管及吸管在冰浴中冷卻。 4．當(dāng)培養(yǎng)物 OD600在 ～ ，開始收獲細(xì)胞 (大約需 2～ )． 5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻 10min。 6．取 10ml培養(yǎng)物置 2個冷離心管中棄去上清液。 7．加入 1ml ／ L CaCl2，再加 CaCl2，置冰浴中放置 20min。 8． 3000r／ min離心 10min，棄去上清液． 9．加入 1ml ／ L CaCl2，重新懸浮細(xì)胞，置冰浴中保存。 10．加入 1～ 20μ l待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 DNA溶液。 11．在冰上放置 20min，在 37℃ 處理 2min。再插入冰中．加入 37℃ 靜置培養(yǎng) 90min。 12．以不同的量涂布選擇培養(yǎng)基平板。 13．于 37℃ 培養(yǎng)過夜。鑒定轉(zhuǎn)化菌落。 常用的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng) ? 自然系統(tǒng) ? 人工誘導(dǎo)（完整細(xì)胞） （ 1）二價陽離子系統(tǒng)： Ca2+， Ca2++Mg2+， Mg2+，Ca2++輔助噬菌體， Tris+Ca 2+ （ 2）單價陽離子系統(tǒng)： PEG+Li+/Cs+/Rb+ （ 3）凍融系統(tǒng) （ 4） Triton處理：人工誘導(dǎo)（ PEG/原生質(zhì)體） 重組 DNA中常用的工具酶 ? 包括限制性核酸內(nèi)切酶 、 DNA連接酶 、DNA聚合酶 、 逆轉(zhuǎn)錄酶等 . 限制性內(nèi)切酶 ? 切開 DNA分子所需的酶：每一種酶都有其各自的作用位點(diǎn) 。 ? 常用限制性內(nèi)切酶 ? 種類及特性 W. Arber,H. O. Smith 限制性內(nèi)切酶的剪切方式 ? 粘性未端：切開后的兩段 DNA各留下一個尾 ，這 2個尾的核苷酸順序完全一樣 ， 中是方向相反 。 它們之間是互補(bǔ)的 ， 在適當(dāng)條件下可以再連接一起 。 其它工具酶 ? 連接酶 T4 DNA ? 修補(bǔ)工具酶 DNA聚合酶 I ? 末端加工酶 S1核酸酶 ， 堿性磷酸單脂酶 ? 末端轉(zhuǎn)移酶 人工加 polyA 或 polyT 尾 ? 反轉(zhuǎn)錄酶 載體－宿主系統(tǒng) ? 載體 (vector)是攜帶外源 DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的 DNA； ? 一般是通過改造質(zhì)粒 、 噬菌體或病毒等構(gòu)建的 。 載體應(yīng)具備以下條件： ? １、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制； ? ２、具有多種限制酶的單一切點(diǎn)（即所謂多克隆位點(diǎn)）以便外源 DNA插入； ? ３、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽性與陰性重組分子； ? ４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體 DNA與宿主 DNA便于分離； ? ５、對于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動子、增強(qiáng)子、加尾信號等基因表達(dá)元件。 宿主細(xì)胞必須符合以下條件 ? １、對載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒有嚴(yán)格的限制； ? ２、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源 DNA； ? ３、在重組 DNA增殖過程中，不會對它進(jìn)行修飾； ? ４、重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組； ? ５、容易導(dǎo)入重組 DNA分子； ? ６、符合重組 DNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。 目的基因的獲取 ? 一、通過建立基因文庫分離靶基因 ? 基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內(nèi)切酶。 ? cDNA：用 mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈 DNA，再經(jīng) DNA聚合酶的作用產(chǎn)生雙鏈 DNA?？扇コ婧松锘蛑胁槐磉_(dá)的內(nèi)含子。 ? 二、化學(xué)合成法制備 DNA片段 ? 從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。 ? 三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增基因片段 ? 對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（ＰＣＲ），以基因組 DNA或 cDNA模板擴(kuò)增得到目的基因片段。 PCR技術(shù) ? 根據(jù)需擴(kuò)增片段的兩端設(shè)計(jì)引物。 ? 使 DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長）反應(yīng)。 ? 特點(diǎn)：需要很少的 DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。 DNA擴(kuò)增 PCR反應(yīng) DNA片斷的克隆 載體的條件 ： a 復(fù)制起點(diǎn) b 適宜的限制酶切點(diǎn) c 選擇標(biāo)記 ? DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組 DNA技術(shù)的關(guān)鍵 。DNA連接是由 DNA連接酶催化完成的 。 一、 DNA連接酶 ? DNA連接酶催化兩條雙鏈 DNA片段相鄰的 5’磷酸和 3’羥基間形成磷酸二酯鍵 。 ? 在分子克隆中最有用的的 DNA連接酶是來自Ｔ４噬菌體的 DNA 連接酶 。 ? T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于： ? １ 、 連接具有同源互補(bǔ)粘性末端的ＤＮＡ片段； ? ２ 、 連接雙鏈 DNA分子間的平端； ? ３ 、 在雙鏈平端的 DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子 。 重組 DNA導(dǎo)入宿主菌 ? 體外連接的重組 DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制 、 增殖和表達(dá) 。 根據(jù)所采用的載體的性質(zhì) ， 將重組 DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法 。 一、轉(zhuǎn) 化 ? 指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體 ， 將外源基因?qū)胧荏w細(xì)