【正文】 細胞群體的形態(tài)學(xué)特征或一些特別的生化特征應(yīng)在菌種保藏前后保持同一性 ， 以及實驗室中 、 中試車間中和生產(chǎn)發(fā)酵中產(chǎn)品滴度的穩(wěn)定性 ， 后者極為重要 。 ? 對工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種來說 ， 建議保藏菌種的形態(tài)學(xué)和生化特征 (如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生 、 酶活力 、 遺傳特征及生化指標 )應(yīng)在保藏后加以檢測和確定 。 而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時 ， 抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào) 。 不同菌種保藏方法比較 基因工程菌的保藏 ? 由載體質(zhì)粒等攜帶的外源 DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的 、 且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子 。 ? 以液體石蠟作為保藏方法時 ， 應(yīng)對需保藏的菌株預(yù)先作試驗 。 二、礦物油中浸沒保藏 ? 將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏 ， 此方法簡便有效 。 ? 但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯 、 菌體自溶 、 基因突變 。 (4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀 ， 可以將此直接振落入盛有 l～ 2ml液體培養(yǎng)基的試管中 ，輕輕振蕩 5～ l0min， 然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基 。較低的保藏溫度 (20～ 70℃ )對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好 。 11． 干燥后 ， 在 ～ ． 12． 在所有安瓿都封蓋好后 ， 撤去真空 。 7． 維持 40℃ 的醇浴溫度 90120min， 然后調(diào)節(jié)溫控裝置 。 5． 輕輕振蕩安瓿 ， 以使細胞重新懸浮 。 2． 將冷凍槽置于歧管之下方 。 ? 大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏 10年之久而不喪失活力 。 (三 )復(fù)蘇 1． 從液氮罐中取出所需的安瓿 ， 立即置于冰浴中； 2． 迅速將安瓿置于 3740℃ 水浴中 ， 并輕輕搖動以加速解； 3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取 (約 8滴 )轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。 所使用的甘油 — 般用高壓蒸汽滅菌 ， 而二甲亞砜最好為過濾滅菌 。 ? ? 如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含 10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。 ? 保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度 ， 培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴格密封 。 冷凍保藏種類 一 、 普通冷凍保藏技術(shù) (20℃ ) 二 、 超低溫冷凍保藏技術(shù) (60一 80℃ ) 三 、 液氮冷凍保藏技術(shù) 普通冷凍保藏技術(shù) (20℃) ? 將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細胞分接到試管或指管肉 ， 然后貯藏于一冰箱的冷藏室中 ，或于溫度范圍在 5～ 20℃ 的普通冰箱 (20℃ )中 。 一般而言 ，冷凍溫度愈低 ， 效果愈好 。 (3)菌種保藏的基本措施是低溫 、 干燥 、 真空 。 ? 將它們轉(zhuǎn)接入含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中時，變異株能迅速利用誘導(dǎo)底物進行生長繁殖，而誘導(dǎo)型出發(fā)菌株需經(jīng)歷一個誘導(dǎo)合成酶的階段，兩類菌株的生長就不同步，組成酶變異株所占的比例將逐漸增大。 ? 為了提高組成酶變異株的優(yōu)勢，即它在群體中的比例，可以應(yīng)用恒化器培養(yǎng)技術(shù)。 ? 組成酶變異株的篩選 許多水解酶是誘導(dǎo)酶，只有在含有底物或底物類似物的培養(yǎng)環(huán)境中，微生物才會合成這些酶類，所以，誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)不僅需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物的種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物的影響。營養(yǎng)缺陷型的篩選一般包括濃縮、進一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。 ? 復(fù)篩的目的是確認符合生產(chǎn)要求的菌株，所以，復(fù)篩步驟以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標。 ? 為了花費最少的工作量，在最短的時間內(nèi)取得最大的篩選成效，就要求采用效率較高的科學(xué)篩選方案和手段。 化學(xué)的早期鑒別一般對產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進行紙上層析 、 薄板層析 、 紙上電泳 、 抗茵譜 、 高壓電泳 、 紫外分光光度法 、 液相和氣相色譜等試驗 ， 井獲得各種圖譜 ， 與已知圖譜進行比較鑒別 。 通過預(yù)篩選 ， 直接測定最初分離物的生物活性 ， 能加速篩選過程 。 四、篩選微生物代謝產(chǎn)物的方法 ? (一 )直接方法 ? 為了盡快確定微生物代謝產(chǎn)物的利用前途 ， 在體外試驗測得活性后 ， 可以將培養(yǎng)液的有效成分直接作用于機體 ， 觀察被測樣品的療效 。 ? (3)利用微生物轉(zhuǎn)化改造代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。 另外 ， 最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化 。 影響原生質(zhì)體制備的因素 1． 菌體的前處理 為了使酶作用的效果好一些 ， 可將菌作一些前處理 。 采用抗藥性菌株除可作標記外 ， 在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾 。 5． 選擇性培養(yǎng)基上劃線生長 ， 分離驗證 ， 挑取融合子進一步試驗 、 保藏 。 二、原生質(zhì)體融合育種步驟 1． 標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證 。 (四 )存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性 。 ? 原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會上提出來的 。 ? 酵母的雜交方法有孢子雜交法 、 群體交配法 、單倍體細胞雜交法和罕見交配法 。 ? 單倍體細胞具 α 及 ε 2兩種交配型 。 ? 大腸桿菌中存著致育因子 F， 有 F因子為 F+， 沒有F因子稱 F。 ? 而重組子由于基因插入使 α －肽基因失活 ， 不能形成 α －互補 ， 在含 Xgal的平板上 ， 含陽性重組子的細菌為無色菌落或噬菌斑 。 一、抗藥性標志的篩選 ? 如果克隆載體帶有某種抗藥性標志基因如 ampr或 tetrr ， 轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落 ，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來 。 但習(xí)慣上常把以噬菌體 DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染 。 ? 此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細菌 ， 它的優(yōu)點是操作簡便 、 轉(zhuǎn)化效率高 、 適用于任何菌株 。 重組 DNA導(dǎo)入宿主菌 ? 體外連接的重組 DNA分子必須導(dǎo)入適當?shù)氖荏w細胞中才能大量的復(fù)制 、 增殖和表達 。DNA連接是由 DNA連接酶催化完成的 。 PCR技術(shù) ? 根據(jù)需擴增片段的兩端設(shè)計引物。 ? cDNA：用 mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈 DNA，再經(jīng) DNA聚合酶的作用產(chǎn)生雙鏈 DNA。 其它工具酶 ? 連接酶 T4 DNA ? 修補工具酶 DNA聚合酶 I ? 末端加工酶 S1核酸酶 ， 堿性磷酸單脂酶 ? 末端轉(zhuǎn)移酶 人工加 polyA 或 polyT 尾 ? 反轉(zhuǎn)錄酶 載體－宿主系統(tǒng) ? 載體 (vector)是攜帶外源 DNA進入宿主細胞進行擴增和表達的 DNA； ? 一般是通過改造質(zhì)粒 、 噬菌體或病毒等構(gòu)建的 。鑒定轉(zhuǎn)化菌落。 11．在冰上放置 20min，在 37℃ 處理 2min。 6．取 10ml培養(yǎng)物置 2個冷離心管中棄去上清液。 (二 )操作步驟： 質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 1．從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入 10ml肉湯培養(yǎng)基中， 37℃ 培養(yǎng)過夜。 在自然條件下，許多質(zhì)?？山?jīng)細菌接合或相似方式在宿主間相互轉(zhuǎn)移。 每個細胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù) 。 在 5～ 6個平皿上可測 20株菌以上 。 待凝固后 ， 分別在平皿的 5～ 6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片 。 這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型 。 (二 )點種法 ? 也就是任意法 。 (一 )影印法 ? 4 ． 將 CM和 MM在恒溫箱中培養(yǎng) 。 三、檢出缺陷型 ? 原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上 ， 生長情況完全不同 ， 缺陷型在 CM上生長良好 ，而在 MM上則不生長 ， 野生型都能生長 。 篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟 ? 誘變 ? 淘汰野生型 ? 檢出缺陷型 ? 確定生長譜 一、誘變方法 ? 物理誘變 ? 化學(xué)誘變 二、淘汰野生型 ? 抗生素法：野生型能在 MM中生長 ， 而缺陷型不能 ， 于是將誘變處理液在 MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長 ， 處于活化階段 ， 而缺陷型無法生長 ， 仍處于休眠狀態(tài) 。 ? 能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基 (MM)； ? 在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分的稱補充培養(yǎng)基 (SM)； ? 能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基(CM)， 如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 、 麥芽汁培養(yǎng)基等 。 4．死亡率計算 將未處理的孢子液 1ml加入 1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離， 30℃ 下培養(yǎng) 3天。 MNNG的誘變作用隨 pH的升高而增強 。 7．挑取菌落進行篩選。 操作均應(yīng)在紅燈下進行 ，或用黑紙包住 ， 避免白熾光 。 2． 將菌懸液放入一巳滅菌的 ， 裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動 ， 以打散菌體 。 ? 被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為 106個／ ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為 106～ 107個／ ml。在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株 ， 最后才能選得優(yōu)秀菌株 。 (五 )分離和篩選 ? 篩選分初篩和復(fù)篩 。 (四 )中間培養(yǎng) 由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前 ， 有一個表現(xiàn)延遲的過程 ， 即細胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程 (生理延遲 )， 需 3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來 。 6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復(fù)處理會使細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。 2． 在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像 ， 也是良好的出發(fā)菌株 。 4． 紫外線仍十分有效 。 誘變劑的選擇 1． 堿基類似物和羥胺具有很高的特異性 ， 但很少使用 ， 回復(fù)突變率高 ， 效果不大 。 化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟的 ， 因為只需要少量的合適的誘變劑 ， 設(shè)備是實驗室的一般玻璃器皿 ，一個蒸氣罩 。 ? 其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的 ， 有一定的穿透力 ， 一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用 ，否則有一定危險性 。 第四節(jié) 誘變育種 ? 以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機率并不很高 ， 一個基因的自然突變頻率僅 1061010左右 。 ? (2)誘導(dǎo)解除基因表達抑制的突變 。 (5)改進菌種外泌產(chǎn)品的能力 。 工業(yè)菌種改良方法 (1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟 ， 由此提供一個旁路代謝途徑 。 ? (2)希望基因型的選出 。 進行類似新種篩選分離 ， 達到獲得新的優(yōu)良生產(chǎn)菌種的目的 。 ? 水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離 。 選擇性抑制培養(yǎng)基可使非目標微生物消除或減少到一定程度。 改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的分離 。 ? 成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不同的生長形態(tài) 、 從而初步地加以鑒定 ，在分離放線菌時顯得尤為重要 。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。 ? 選擇性地添加抗生素 。 (二 )生態(tài)學(xué)參數(shù) ? 放線菌分離培養(yǎng)過程中所需考慮的生態(tài)參數(shù)有溫度 、 pH、 離子強度 、 氧化還原電勢和底物濃度 。 將認為有希望的菌落用牙簽轉(zhuǎn)接到另一模擬分離瓊脂平板上進行篩選 。 ? 通過改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細菌 、 中溫菌和嗜高溫菌 。用樣本稀釋液適度稀釋 ,涂布平板倒置培養(yǎng)或濾紙壓印分離法。 ? 富集可以促進抗性的產(chǎn)生并維持下來。 培養(yǎng)基的生物物理學(xué)參數(shù)，如 pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。 就分離培養(yǎng)基的組成而言 ， 部分培養(yǎng)基中必須含有 1050%的天然提取物 。 采集瓶從水中取出時應(yīng)迅速并帶有較大的弧度 。 3．水樣采集方法 ? 用于細菌檢測的水樣應(yīng)收集于