【文章內(nèi)容簡介】 期使用誘變劑處理之后 ， 其 生活能力 一般要逐漸下降 ， 例如 生長周期延長 ，孢子量減少 ， 代謝減慢 ， 產(chǎn)量增加緩慢 ， 誘變因素對產(chǎn)量基因影響的有效性降低 等 。 因此 ， 有必要利用 雜交育種方法 。 雜交育種 是指將兩個 基因 型不同的菌株經(jīng) 吻合 （ 或接合 ） 使 遺傳物質(zhì)重新組合 ， 從中 分離和篩選 具有新性狀的菌株 。 雜交育種的目的 在于： 1） 通過雜交使不同菌株的 遺傳物質(zhì)進行交換和重新組合 ， 從而改變原有菌株的 遺傳物質(zhì)基礎(chǔ) ， 獲得雜種菌株 （ 重組體 ） ； 2） 可以通過雜交把 不同菌株 的 優(yōu)良生產(chǎn)性能集中于重組體中 ， 克服長期用誘變劑處理造成的 菌株生活力下降等缺陷 ； 3）通過雜交 ，可以 擴大變異范圍 ， 改變產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量 ，甚至出現(xiàn)新的品種 ； 4）分析雜交結(jié)果 ，可以總結(jié) 遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律 ， 促進遺傳學理論的發(fā)展 。 微生物 雜交育種 所使用的 配對菌株 稱為 直接親本 。 由于 多數(shù)微生物尚未發(fā)現(xiàn)其有性世代 ， 因此 ， 直接親本菌株應(yīng)帶有適當?shù)?遺傳標記 。 常用的遺傳標記有 顏色 、 營養(yǎng)要求和抗藥性 等 。 營養(yǎng)標記菌株 （ 即 營養(yǎng)缺陷型菌株 ） 是最常用的遺傳標記之一 。 所謂 營養(yǎng)缺陷型菌株 是微生物經(jīng)誘變劑處理后產(chǎn)生的一種 生化突變體 。由于 基因突變 ， 它失去了 合成某種物質(zhì) （ 氨基酸 、 維生素或核苷酸堿基 ）的能力 ， 在 基本培養(yǎng)基上不能生長 ， 大多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株需要補加 一定種類的有機物質(zhì) 后 才能生長 。 遺傳標記 所謂 原生質(zhì)體融合 就是把兩個親本的細胞壁分別通過酶解作用加以瓦解 ， 使菌體細胞在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包裹著的球狀體 （ 稱 原生質(zhì)體 ） 。 兩親本的原生質(zhì)體在 高滲條件下 使之混合 ， 由聚乙二醇（ PEG） 作為 助融劑 ， 使它們互相凝集 ， 發(fā)生 細胞融合 ， 接著兩親本基因組 由接觸到交換 ， 從而 實現(xiàn)遺傳重組 。 在再生成細胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的 重組子 。 原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性 從現(xiàn)有資料看 ， 原生質(zhì)體融合技術(shù) 有以下 優(yōu)點 （ l）去除了細胞壁的障礙 ，親株基因組 直接融合、交換，實現(xiàn)重組，不需要有已知的遺傳系統(tǒng) 。即使是 相同接合型的真菌細胞 也能發(fā)生原生質(zhì)體的相互融合， 并可對原生質(zhì)體進行 轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染 。 （ 2） 原生質(zhì)體融合后 兩親株的基因組之間 有機會發(fā)生 多次交換 ， 產(chǎn)生各種各樣的基因組合而得到多種類型的 重組子 。 參與融合的親株數(shù)并不限于一個 ， 可以多至三個 、 四個 ，這足一般常規(guī)雜交所達不到的 。 （ 3） 重組頻率特別高 ， 因為有聚乙二醇作助融劑 。 （ 4） 可以和其他育種方法相結(jié)合 ， 把由其它方法得到的優(yōu)良性狀通過原生質(zhì)體融合再組合到一個單株中 。 （ 5） 可以用溫度 、 藥物 、 紫外線等處理 、 鈍化親株的一方或雙方 ， 然后使之融合 ， 再在再生菌落中 篩選重組子 。 這樣往往可以提高篩選效率 。 由于以上優(yōu)點 ， 利用原生質(zhì)體融合來培育工業(yè)新菌株已受到國內(nèi)外普遍重視 。 原生質(zhì)體融合技術(shù)一般步驟 選擇親株 選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補的兩個親株； 親株帶上遺傳標記； 測定遺傳標記的穩(wěn)定性 。 原生質(zhì)體制備 一般采用酶解法除壁 。 根據(jù)微生物細胞壁組成和結(jié)構(gòu)的不同 ， 采用不同的酶 ， 有時還要采取一些措施 ， 如添加甘氨酸 、蔗糖或抗生素等 ， 以提高細胞壁對酶解的敏感性； 原生質(zhì)體對滲透壓極其敏感 ， 低滲易引起細胞破裂 。 一般將原生質(zhì)體放在高滲的環(huán)境中維持它的穩(wěn)定 。 原生質(zhì)體融合 ? 兩親本的原生質(zhì)體在 高滲條件下 使之混合，由聚乙二醇（ PEG）作為 助融劑 ，使它們互相凝集，發(fā)生 細胞融合 ，接著兩親本基因組 由接觸到交換 ，從而 實現(xiàn)遺傳重組 。在再生細胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的 重組子 。 原生質(zhì)體再生 原生質(zhì)體再生 就是使原生質(zhì)體重新長出細胞壁 ， 恢復完整的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)； 為獲得較高的再生率 ， 在實驗過程中應(yīng)避免剪切力過大使原生質(zhì)體破裂； 涂布時 ， 原生質(zhì)體濃度不宜過高； 菌齡 、 再生時的溫度 、 溶菌酶用量和溶壁時間等因素都會影響原生質(zhì)體的再生 。 篩選優(yōu)良性狀融合重組子 ? 原生質(zhì)體融合后，來自兩親代的遺傳物質(zhì)經(jīng)過交換并發(fā)生重組而形成的子代稱為 融合重組子。 ? 融合重組子的檢出方法： ? 直接法 將融合液涂布在不補充親株生長需要的生長因子高滲再生培養(yǎng)基平板上，直接篩選出原養(yǎng)型重組子。 ? 間接法 把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落，然后用影印法將它們復制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。 ? 篩選出來的融合重組子還需要對它們進行生理生化及生產(chǎn)性能的測定。 第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的擴大培養(yǎng) ? 種子擴大培養(yǎng) ：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于 休眠狀態(tài) 的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定 數(shù)量 和 質(zhì)量 的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為 種子 。 作為種子的準則 ? 菌種細胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短； ? 生理性狀穩(wěn)定； ? 菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求； ? 無雜菌污染； ? 保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。 種子擴培的目的 ? 接種量的需要 ? 菌種的馴化 ? 縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平 種子的制備過程 ? 種子制備的過程大致可分為： ? 實驗室種子制備階段 ? 生產(chǎn)車間種子制備階段 一、實驗室種子的制備 ?實驗室種子的制備一般采用兩種方式 ? 對于產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以 采用固體培養(yǎng)基或斜面（靜置培養(yǎng)）培養(yǎng)孢子 ，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。 ? 對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用 液體培養(yǎng)法 (通過搖瓶培養(yǎng)提供比較好的溶氧）。 （一）孢子的制備 細菌孢子的制備 ? 細菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。 ? 培養(yǎng)溫度一般為 37?C。 ? 細菌菌體培養(yǎng)時間一般為 1~2天，產(chǎn)芽孢的細菌培養(yǎng)則需要 5~10天。 霉菌孢子的制備 ? 霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。 ? 培養(yǎng)的溫度一般為 25~28?C。 ? 培養(yǎng)時間一般為 4~14天。 放線菌孢子的制備 ? 放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。 ? 培養(yǎng)溫度一般為 28?C。 ? 培養(yǎng)時間為 5~14天。 （二）液體種子制備 好氧培養(yǎng)： 對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌