【正文】 第二章 菌種選育 本章主要內(nèi)容 ?第一節(jié) 菌種的分離篩選 ?第二節(jié) 菌種選育 ?第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) ?第四節(jié) 菌種的保藏與復(fù)壯 第一節(jié) 菌種的分離篩選 一、菌種的來源 ? 根據(jù)資料直接向有科研單位 、 高等院校 、 工廠或菌種保藏部門索取或購(gòu)買； ? 從大自然中分離篩選新的微生物菌種 。 二、分離思路 ? 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求 、 菌種的特性 ， 采用各種篩選方法 ，快速 、 準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來 。 ? 實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌 ， 也必須重新進(jìn)行分離純化 。 ? 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。 ? 定方案： 首先要查閱資料 ， 了解所需菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)特性 。 ? 采樣： 有針對(duì)性地采集樣品 。 ? 增殖： 人為地通過控制養(yǎng)分或培條件 ， 使所需菌種增殖培養(yǎng)后 ， 在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì) 。 ? 分離篩選： 采用選擇性培養(yǎng)基利用分離技術(shù)得到純種目的菌 。 ? 發(fā)酵性能測(cè)定： 進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定 。 這些特性包括形態(tài) 、培養(yǎng)特征 、 營(yíng)養(yǎng)要求 、 生理生化特性 、 發(fā)酵周期 、 產(chǎn)品品種和產(chǎn)量 、 耐受最高溫度 、 生長(zhǎng)和發(fā)酵最適溫度 、 最適 pH值 、 提取工藝等 。 三、新種分離與篩選的步驟 （ 一）采樣 采樣對(duì)象 以采集土壤為主 。 一般園田土和耕作過的沼澤土中 ， 以細(xì)菌和放線菌為主 ， 富含碳水化合物的土壤和沼澤地中 ， 酵母和霉菌較多 ，如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi) 。 采樣的對(duì)象也可以是植物 ， 腐敗物品 ， 某些水域等 。 從自然界篩選 ? 采樣季節(jié)：以溫度適中 ， 雨量不多的秋初為好 。 ? 采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后 ， 用小薩子除去表土 ， 取離地面 515cm處的土約 10g， 盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中 ， 扎好 ， 標(biāo)記 ， 記錄采樣時(shí)間 、 地點(diǎn) 、 環(huán)境條件等 ， 以備查考 。 為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化 ， 宜將樣品逐步分批寄回 ， 以便及時(shí)分離 。 采取土壤樣品要考慮的幾個(gè)問題 ? 土質(zhì)肥，微生物含量高，特別肥沃的土壤中細(xì)菌多，放線菌少；在植物殘?bào)w枯枝落葉下的土壤中較多含有拮抗性真菌。 ? 離地面 5~20cm處的土壤通氣良好、不受陽光直射，含菌量最高。 ? 采土季節(jié)以春秋兩季最好。 ? 采土方法：選擇適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)、鏟除表土、取土樣數(shù)十克，盛入事先準(zhǔn)備的無菌防水紙袋中，其上記錄采土?xí)r間、地點(diǎn)、植被情況等。 ? 多點(diǎn)采土、混合分離，可以代表每一地塊上的微生物分布平均情況 （二）增殖培養(yǎng) ? 含有目的菌較多的土樣不需要富集培養(yǎng) ? 如果原有樣品中目的菌含量低，可以人為地添加相應(yīng)的基質(zhì)，培養(yǎng)使之以較其它微生物更快的速度生長(zhǎng)繁殖，從而提高它們?cè)跇悠分械谋壤?，便于分離。 ? 富集培養(yǎng)的一般方法：采用有利于目的菌種而不利于無關(guān)微生物的營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件，以達(dá)到使目的菌種在群體中比例上升的目的。 ? 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng)，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對(duì)下階段的純種分離就會(huì)順利得多。 ? 一些有特定物質(zhì)產(chǎn)生能力的菌種，不容易富集，只有通過大量艱苦的工作篩選取得。 某些細(xì)菌的富集條件 富集對(duì)象 接種菌樣 添加營(yíng)養(yǎng)物 (g) 特殊培養(yǎng)條件 好氧氨基酸氧化菌 土壤 – 好氧， 好氧性芽孢桿菌 土壤，巴氏消毒 – 好氧， 氨基酸發(fā)酵性梭菌 土壤，巴氏消毒 – 厭氧， 耐堿解尿素芽孢菌 土壤，巴氏消毒 尿素 50 好氧， 厭氧八疊球菌 土壤 葡萄糖 20 厭氧， pH2~3 乳酸菌 植物體或牛奶 葡萄糖 20 厭氧， 腸道細(xì)菌 土壤或污水 葡萄糖 20， CaCO320 好氧或厭氧， 丙酸菌 干酪 乳酸鈉 20 厭氧， 醋酸菌 果實(shí)或生啤酒 乙醇 40 好氧， 注：培養(yǎng)基成分為酵母膏 10g， KH2PO4或 K2HPO4 ， MgSO47H2O ，加水 1000ml。一般培養(yǎng)在 30℃ 下。 （三）培養(yǎng)分離 ? 盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著 ， 但還是處于微生物的混雜生長(zhǎng)狀態(tài) 。 因此還必須分離 ， 純化 。 在這 —步 ， 增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用 ，而且控制得細(xì)一點(diǎn) ， 好一點(diǎn) 。 純種分離的方法有劃線分離法 、 稀釋分離法 。 稀釋分離法 ? 稀釋倒 平板法 ? 平板 涂布法 注意：必須要做多個(gè)濃度的稀釋分離平板。 ? 劃線分離法 —— 平板劃線法 （四）篩 選 初篩：從分離得到的大量微生物中，將目標(biāo)微生物 篩選出來的過程。 常用的初選方法： ? 水解酶產(chǎn)生菌的篩選： 將酶的作用底物加在培 養(yǎng)基中，接種后適溫培 養(yǎng)，根據(jù)菌苔周圍是否 產(chǎn)生水解圈篩選出水解 酶產(chǎn)生菌。 一般采用平板篩選。 ? 拮抗菌的篩選 — 對(duì)峙培養(yǎng)： 將病原指示菌與待測(cè)菌株 相對(duì)接種在平板上適溫培 養(yǎng)，根據(jù)病原菌的生長(zhǎng)情 況篩選出拮抗性菌株。 分初篩、復(fù)篩。 2）搖瓶發(fā)酵篩選：將待測(cè)菌株進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)，取 發(fā)酵濾液進(jìn)行活力測(cè)定。 復(fù)篩：在初篩的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步鑒定有希望菌株的 生產(chǎn)能力強(qiáng)弱的過程。 ? 復(fù)篩采用搖瓶培養(yǎng)后，發(fā)酵液采用精確的分析方法 進(jìn)行測(cè)定。 ? 復(fù)篩過程中，要結(jié)合培養(yǎng)條件進(jìn)行。 培養(yǎng)條件包括：培養(yǎng)基 pH值 發(fā)酵溫度 供氧量等。 （五）菌種鑒定 ? 經(jīng)典分類鑒定方法：形態(tài)特征、生理生化特征、血清學(xué)試驗(yàn)等。 ?現(xiàn)代分類鑒定方法：遺傳特性、細(xì)胞化學(xué)組分、計(jì)算機(jī)數(shù)值分析。 （五）毒性試驗(yàn) ? 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的 ， 將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心 ， 尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種 ， 更應(yīng)慎重 。 據(jù)有的國(guó)家規(guī)定 ， 微生物中除啤酒酵母 、 脆壁酵母 、 黑曲霉 、 米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗(yàn)外 ， 其他微生物作為食用 ， 均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn) 。 第二節(jié) 菌種選育 ? 菌種選育 是一門 應(yīng)用科學(xué)技術(shù) ，其 理論基礎(chǔ) 是微生物 遺傳學(xué)、生物化學(xué) 等，而其研究 目的 是微生物產(chǎn)品的 高產(chǎn)優(yōu)質(zhì) 和發(fā)展 新品種 為生產(chǎn)不斷地 提供優(yōu)良菌種 ，從而促進(jìn)生產(chǎn)發(fā)展。 ? 目前菌種選育常采用