【正文】 種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（ S. griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（ S. Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體（短菌絲），作為種子。 試管 → 三角瓶 → 搖床 → 種子罐 厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 試管 → 三角瓶 → 卡式罐 → 種子罐 二、生產(chǎn)車間種子制備 ?實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。 種子罐的作用 ?主要是使孢子發(fā)芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。 種子罐級數(shù)的確定 ? 種子罐級數(shù)：是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)， 一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)。 ? 種子罐級數(shù)取決于： ? 菌種生長特性（如菌種傳代后的穩(wěn)定性）、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度； ? 所采用發(fā)酵罐的容積 ? 另外還與發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最低 接種量（種子液體積 /培養(yǎng)液體積） 以及種子罐與發(fā)酵罐的容積比等有關(guān)。 ? 細菌：生長快 ， 種子用量比例少 ， 級數(shù)也較少 ， 二級發(fā)酵 。 茄子瓶 → 種子罐 → 發(fā)酵罐 ? 霉菌：生長較慢 ， 如青霉菌 ， 三級發(fā)酵 孢子懸浮液 → 一級種子罐 （ 27?C,40小時孢子發(fā)芽 ， 產(chǎn)生菌絲 ） → 二級種子罐（ 27?C,10~24小時 ， 菌體迅速繁殖 ， 粗壯菌絲體 ） → 發(fā)酵罐 ? 放線菌：生長更慢 ， 采用四級發(fā)酵 ? 酵母：比細菌慢 ， 比霉菌 ， 放線菌快 ，通常用一級種子 （ 二級發(fā)酵 ） 。 ?確定種子罐級數(shù)需注意的問題 ? 種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會 ? 種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機會 ? 雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。 種子質(zhì)量的控制 一、影響孢子質(zhì)量的因素及控制 ?培養(yǎng)基 ?培養(yǎng)條件 ?培養(yǎng)時間和冷藏時間 培養(yǎng)基 ? 生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動。 ? 例如在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質(zhì)量的影響也不同。 ? 蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對孢子影響也不同。 ? 原材料質(zhì)量的波動，起它要作用的是其中無機離子含量不同，如微量元素 Mg2+ 、 Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。 ?水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動，影響種子質(zhì)量。 ?菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。 ?措施 ? 培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗合格才可使用 ? 嚴格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量 ? 斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當溫度下放置一定時間 ? 供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復雜的有機氮源 培養(yǎng)條件 （ 1）溫度 溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。如土霉素生產(chǎn)菌種在高于 37?C培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。一般各生產(chǎn)單位都嚴格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度。 （ 2）濕度 制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌，孢子制備時發(fā)現(xiàn)： 在北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢， 主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。從表中看出相對濕度在 40%~45%時孢子數(shù)量最多，且孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。 培養(yǎng)時間和冷藏時間 （ 1）培養(yǎng)時間 ?一般來說， 衰老的孢子不如年輕的孢子 ，因為衰老的孢子已在逐步進入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子會導致生產(chǎn)能力的下降。 ?措施：孢子培養(yǎng)的時間應(yīng)該控制在 孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常 的階段終止培養(yǎng)。 （ 2）冷藏時間 ? 斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng) 4天左右即于 4?C冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏 7~8天菌體細胞開始自溶。而培養(yǎng) 5天以后冷藏， 20天未發(fā)現(xiàn)自溶。 ? 冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。 例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在 6? C冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低 18%，冷藏 3個月后降低 35%。 接種量 ?接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進而影響菌體的生理狀況。 二、影響種子質(zhì)量的因素及控制 ?孢子的質(zhì)量 ?培養(yǎng)基 ?培養(yǎng)條件 ?種齡 ?接種量 培養(yǎng)基 ?營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要 ? 選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基； ? 營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用； ? 營養(yǎng)成分要適當豐富和完全，氮源和維生素含量要高 ?營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。 培養(yǎng)條件 （ 1）溫度 （ 2）通氣量 （ 3） pH 種齡 ? 種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。 ? 通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數(shù)生長期，菌體量還未達到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。時間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。 ? 不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實驗來確定。Ru 嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶， 12小時最好。 接種量 ? 接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會。但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。 ? 通常接種量，細菌 1~5%，酵母菌 5~10%，霉菌 7~15%，有時 20~25% 三、種子質(zhì)量的控制措施 ?種子質(zhì)量的最終指標是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。 ? 菌種穩(wěn)定性的檢查 ? 無雜菌檢查 四、種子質(zhì)量標準 形態(tài) ?單細胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)；