【正文】 第八章 微生物的遺傳變異與育種 微生物是研究現(xiàn)代遺傳學和其它許多主要的生物學基本理論問題中最熱衷的 研究對象 。 對微生物遺傳規(guī)律的深入研究 ， 不僅促進了 現(xiàn)代分子生物學 和 生物工程學 的發(fā)展 ， 而且為 育種工作 提供了豐富的理論基礎 ， 促使育種工作從不自覺到自覺 、 從低效到高效 、 從隨機到定向 、 從近緣雜交到遠緣雜交的方向發(fā)展 。 研究微生物遺傳學的意義 : 第八章 微生物的遺傳變異與育種 遺傳與變異的概念 遺傳和變異是生物體的最本質(zhì)的屬性之一 。 遺傳 (heredity)： 上一代生物如何將自身的一整套遺傳基因穩(wěn)定地傳遞給子代的 行為或功能 ， 它具有及其穩(wěn)定 （ 保守 ）的特性 。 遺傳型 （ genotype） ：又稱基因型 ， 指某一生物個體所含有的全部基因的總和； 是一種內(nèi)在可能性或潛力 。 遺傳型 + 環(huán)境條件 表型 表型 （ phenotype） ： 指生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和 。是一種 現(xiàn)實存在 ， 是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀 。 代謝 發(fā)育 變異 (variation):生物體在外因 或內(nèi)因的作用下 ， 遺傳物質(zhì)的結(jié)構或數(shù)量發(fā)生改變 。 變異的特點： 率出現(xiàn) ， （ 一般為 106～ 1010） ； ； c. 變化后形成的新性狀是穩(wěn)定的 ， 可遺傳的 。 飾變 （ modification） ： 指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄 、 轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化 。 特點是： 中的每一個個體都發(fā)生同樣的變化； ； c.因遺傳物質(zhì)不變 ， 故飾變是不遺傳的 。 引起飾變的因素消失后 ， 表型即可恢復 。 例如：粘質(zhì)沙雷氏菌： 在 25℃ 下培養(yǎng)，產(chǎn)生深紅色的靈桿菌素；在 37℃ 下培養(yǎng)，不產(chǎn)生色素；如果重新將溫度降到 25℃ ，又恢復產(chǎn)色素的能力。 遺傳與變異的概念 第一節(jié) 遺傳變異的物質(zhì)基礎 遺傳物質(zhì)是什么 ？ 種質(zhì)連續(xù)理論 ： 1883~1889年間 Weissmann提出 。 認為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結(jié)構的化合物 。 基因?qū)W說 ： 1933年摩爾根 （ Thomas Hunt Man） 發(fā)現(xiàn)了染色體 ， 并證明基因在染色體上呈直線排列 ， 提出了基因?qū)W說 ，使得遺傳物質(zhì)基礎的范圍縮小到染色體上 。 但 染色體 是由 核酸 和 蛋白質(zhì) 兩種長鏈高分子組成 。 20多種氨基酸經(jīng)過不同排列組合 ， 可以演變出的蛋白質(zhì)數(shù)目幾乎可以達到一個天文數(shù)字 ， 而核酸的組成卻簡單得多 ， 一般僅由4種不同的核苷酸組成 ， 它們通過排列核組合只能產(chǎn)生較少種類的核酸 ， 因此當時認為決定生物遺傳型的染色體和基因 ，起活性成分是蛋白質(zhì) 。 DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎的證明 ： 1944年以后 ， 先后有利用微生物為實驗對象進行的三個著名實驗的論證： 肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗； 噬菌體感染試驗； 病毒的拆開與重建試驗 。 才使人們普遍接受 核酸 才是真正的遺傳物質(zhì) 。 1928年， Griffith進行了以下幾組實驗： （ 1）動物實驗 對小鼠注射活 RII菌或死 SIII菌 ————小鼠存活 對小鼠注射活 SIII菌 ————————小鼠死亡 對小鼠注射活 RII菌和熱死 SIII菌 ———小鼠死亡 抽取心血 分離 活的 SIII菌 一 、 證明核酸是遺傳物質(zhì)基礎的三個經(jīng)典實驗 （ 一 ） 經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗 （ transformation） ： ， 研究對象： Streptococcus pneumoniae（ 肺炎雙球菌 ） SIII型菌株：有莢膜 ， 菌落表面光滑 ， 有致病性 RII型菌株：無莢膜 ， 菌落表面粗糙 ， 無致病性 Griffith 轉(zhuǎn)化試驗示意 混合培養(yǎng) RII型活菌 SIII型活菌 SIII型熱死菌 RII型活菌 SIII型活菌 健康 健康 健康 健康 健康 健康 健康 病死 病死 病死 （ 2） 細菌培養(yǎng)實驗 （ 3） S型菌的無細胞抽提液試驗 以上實驗說明：加熱殺死的 SIII型細菌細胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進入 RII型細胞并使 RII型細胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀，轉(zhuǎn)變?yōu)?SIII型細胞。 熱死 SIII菌 —————不生長 活 RII 菌 —————長出 RII菌 熱死 SIII菌 —————長出大量 RII菌和 106SIII菌 活 R菌 +S菌無細胞抽提液 ——長出大量 R菌和少量 S菌 +活 RII菌 平皿培養(yǎng) ① 加 S菌 DNA ② 加 S菌 DNA及 DNA酶以外的酶 ③ 加 S菌的 DNA和 DNA酶 ④ 加 S菌的 RNA ⑤ 加 S菌的蛋白質(zhì) ⑥ 加 S菌的莢膜多糖 活 R菌 長出 S菌 只有 R菌 1944年 、 M. McCarty從熱死 S型 S. pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分 ， 并在離體條件下進行了轉(zhuǎn)化試驗： 只有 S型細菌的 DNA才能將 S. pneumoniae的 R型轉(zhuǎn)化為 S型 。 且 DNA純度越高 ， 轉(zhuǎn)化效率也越高 。 說明 S型菌株轉(zhuǎn)移給 R型菌株的 ， 是遺傳因子 。 （ 二 ） 噬菌體感染實驗 A. D. Hershey和 M. Chase， 1952年 （ 1） 含 32PDNA的一組：放射性 85%在沉淀中 10分鐘后 用搗碎器 使空殼脫離 吸附 離心 沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體 上清液中含 15%放射性 沉淀中含 85%放射性 沉淀中含 25%放射性 以 35S標記蛋白質(zhì)外殼做噬菌體感染實驗 （ 2） 含 35S蛋白質(zhì)的一組：放射性 75%在上清液中 10分鐘后 用搗碎器 使空殼脫離 吸附 離心 沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體 上清液中含 75%放射性 （ 三 ） 植物病毒的重建實驗 為了證明核酸是遺傳物質(zhì) ， H. FraenkelConrat（ 1956） 用含 RNA的 煙草花葉病毒（ TMV） 進行了著名的植物病毒重建實驗 。 將 TMV在一定濃度的 苯酚 溶液中振蕩 ， 就能將其蛋白質(zhì)外殼與 RNA核心相分離 。 分離后的 RNA在沒有蛋白質(zhì)包裹的情況下 ， 也能感染煙草并使其患典型癥狀 ， 而且在病斑中還能分離出正常病毒粒子 。 選用 TMV和霍氏車前花葉病毒（ HRV） ， 分別拆分取得各自的 RNA和蛋白質(zhì) ， 將兩種RNA分別與對方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒： （ 1） RNA（ TMV） 蛋白質(zhì) （ HRV） （ 2） RNA（ HRV） 蛋白質(zhì) （ TMV） 用兩種雜合病毒感染寄主： （ 1） 表現(xiàn) TMV的典型癥狀病分離到正常 TMV粒子 （ 2） 表現(xiàn) HRV的典型癥狀病分離到正常 HRV粒子 。 上述結(jié)果說明 ， 在 RNA病毒中 ，遺傳的物質(zhì)基礎也是核酸 。 MTV HRV HRV MTV 上述結(jié)果說明 ， 在 RNA病毒中 ， 遺傳的物質(zhì)基礎也是核酸 。 ?（一）核酸存在的七個水平 ?細胞水平：存在于細胞核或核質(zhì)體，單核或多核 ?細胞核水平 : 原核與真核生物的細胞核結(jié)構不同，核外 DNA ?染色體水平 : 倍性 (真核 )和染色體數(shù) ?核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或 RNA，復合或裸露，雙鏈或單鏈 ?基因水平：具自主復制能力的遺傳功能單位，長度與信息量， 轉(zhuǎn)錄 ——翻譯 ?密碼子水平： 信息單位，起始和終止 ?核苷酸水平： 突變或交換單位，四種堿基 二、遺傳物質(zhì)在細胞內(nèi)的存在部位和方式 （ 二 ） 原核生物的質(zhì)粒 定義 ：是一類小型閉合環(huán)狀核外雙螺旋 DNA分子 ， 能獨立于細胞 核進行自主復制 。 大小 ：約為 2100 106Dalton， 上面攜帶有數(shù)個到數(shù)十個甚至 上百個基因 。 性質(zhì) ： ① 可以在細胞質(zhì)中獨立于染色體之外獨立存在 （ 游離態(tài) ） ， 也可以通過交換摻入染色體上 ， 以附加體 （ episome） 的形式存在； ② 質(zhì)粒是一種復制子 （ replicon） ， 根據(jù)自我復制能力的不同 ， 可把質(zhì)粒復制的控制形式分為嚴緊型和松弛型兩種 ， 嚴緊型質(zhì)粒的復制受細胞核控制 ， 與染色體 DNA復制相伴隨 ,一般一個寄主細胞內(nèi)只有少數(shù)幾個 （ 15） 個拷貝；松弛型質(zhì)粒的復制不受細胞核控制 ， 在染色體 DNA復制停止的情況下仍可以進行復制 ， 在細胞內(nèi)的數(shù)量可以達到 10200個或更多 。 ③ 可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或接合作用而由一個細菌細胞轉(zhuǎn)移到另一個菌細胞中，使兩個細胞都成為帶有質(zhì)粒的細胞； 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時，它可以單獨轉(zhuǎn)移，也可以攜帶著染色體（片段）一起進行轉(zhuǎn)移，所以它可成為基因工程的載體。 ④ 對于細菌的生存并不是必要的 ⑤ 功能多樣化 功能 ：進行細胞間接合，并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。 重組 ：在質(zhì)粒之間、質(zhì)粒與染色體之間菌可發(fā)生。 存在范圍 ：很多細菌如 、 Shigella、 、Streptococcus lactis、根癌土壤桿菌等 制備 ：包括增殖、裂解細胞、分離質(zhì)粒與染色體和蛋白質(zhì)等成分、去除 RNA和蛋白質(zhì)等步驟。 鑒定 ：電鏡觀察、電泳、密度梯度離心、限制性酶切圖譜等方法 三、原核生物的質(zhì)粒 幾種代表性質(zhì)粒： 1. F–因子 （ fertility factor） ： 又稱 致育因子 或 性因子 ， 62 106Dalton ， 相當于核染色體 DNA 2%的環(huán)狀雙鏈DNA， 足以編碼 94個中等大小多肽 ， 其中 1/3基因（ tra區(qū) ） 與接合作用有關 。 存在于腸細菌屬 、 假單胞菌屬 、 嗜血桿菌 、 奈瑟氏球菌 、 鏈球菌等細菌中 ， 決定性別 。 Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes. 最初發(fā)現(xiàn)于痢疾志賀氏菌（ Shigella dysenteriae），后來發(fā)現(xiàn)還存在于 Salmonella、 Vibrio、 Bacillus、 Pseudomonas和 Staphylococcus中。 –R因子由相連的兩個 DNA片段組成，即 抗性轉(zhuǎn)移因子（ resistence transfor factor， RTF ）和 抗性決定因子（ rdeterminant）， RTF為分子量約為 11 106Dalton，控制質(zhì)粒 copy數(shù)及復制，抗性決定質(zhì)粒大小不固定，從幾百萬到 100 106Dalton以上。其上帶有其它抗生素的抗性基因。 –R因子在細胞內(nèi)的 copy數(shù)可從 1~2個到幾十個，分為嚴緊型和松弛型兩種，經(jīng)氯霉素處理后，松弛型質(zhì)?？蛇_2022~3000個 /細胞。 2. R因子（ resistence factor） 產(chǎn)大腸桿菌素因子 。 大腸桿菌素 是由 ， 能通過抑制復制 、 轉(zhuǎn)錄 、 轉(zhuǎn)譯或能量代謝等而專一地殺死其它腸道細菌 。 其分子量約 4 104~8 104Dalton。 大腸桿菌素都是由 Col因子編碼的 。 Col因子可分為兩類 ， 分別以 ColE1和 ColIb為代表 。 凡帶 Col因子的菌株 ， 由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白 ， 從而對大腸桿菌素有免疫作用 ， 不受其傷害 。 ?3. Col因子 （ colicinogenic factor） ?降解性質(zhì)粒 – 只在 假單胞菌屬 中發(fā)現(xiàn)。它們的降解性質(zhì)?？蔀橐幌盗心芙到鈴碗s物質(zhì)的酶編碼，從而能利用一般細菌所難以分解的物質(zhì)做碳源。這些質(zhì)粒以其所分解的底物命名，例如有分解 CAM（樟腦）質(zhì)粒， XYL（二甲苯）質(zhì)粒，SAL（水楊酸）質(zhì)粒， MDL（扁桃酸）質(zhì)粒， NAP（奈）質(zhì)粒和 TOL（甲苯）質(zhì)粒