【文章內(nèi)容簡介】 組移動 （ ＋或－ ） 紫外線 形成嘧啶的水合物 GC→AT轉(zhuǎn)換 形成嘧啶的二聚體 碼組移動 （ ＋或－ ） 交 聯(lián) 電離輻射 堿基的羥基化核降解 AT=GC雙向轉(zhuǎn)換 DNA降解 碼組移動 （ ＋或－ ） 糖 磷酸骨架的斷裂 巨大損傷 （ 缺失 、 重復(fù) 、 倒位 、 易位 ） 喪失嘌呤 加熱 C脫氨基 CG→TA轉(zhuǎn)換 Mu噬菌體 結(jié)合到一個基因中間 碼組移動 （ 2） 移碼突變 移碼突變： 指誘變劑使 DNA分子中增加 （ 插入 ） 或缺失一個或少數(shù)幾個核苷酸 ， 從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的一類突變 。 由移碼突變所產(chǎn)生的突變株 ， 稱為 移碼突變株 （ frameshift mutant） 。 與染色體畸變相比 ， 移碼突變也只能算是DNA分子的微小損傷 。 丫啶類染料 ， 包括原黃素 、 丫啶黃 、 丫啶橙和 α氨基丫啶等 ， 以及一系列稱為 ICR類的化合物 ， 都是移碼突變的有效誘變劑 。 圖 814——能誘發(fā)移碼突變的幾種代表性化合物 引起移碼突變的誘變劑：主要是 吖啶類染料 ，如吖啶黃、吖啶橙等等。 這類化合物都是平面型的三環(huán)分子，它們的結(jié)構(gòu)與一個嘌呤 —嘧啶對十分相似。 丫啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示： （ 3） 染色體畸變 （ chromosomal aberration） 某些強(qiáng)烈理化因子 ， 如 X射線 等的輻射及 烷化劑 、亞硝酸 等 ， 除了能引起點突變外 ， 還會引起 DNA的大損傷 （ macrolesion） ——染色體畸變 ， 它包括： 染色體結(jié)構(gòu)上的變化： 缺失 （ deletion） ； 重復(fù) （ duplication） ； 易位 （ translocation） ； 倒位 （ inversion） ； 染色體數(shù)目的變化 。 ★ 染色體結(jié)構(gòu)上的變化 分為 染色體內(nèi)畸變 和 染色體間畸變 兩類 。 染色體內(nèi)畸變：只涉及一條染色體上的變化 ， 如發(fā)生染色體的部分缺失或重復(fù)時 ， 其結(jié)果可造成基因的減少或增加； 如發(fā)生 倒位 或 易位 時 ， 則可造成基因排列順序的改變 ，但數(shù)目卻不改變 。 倒位 是指斷裂下來的一段染色體旋轉(zhuǎn) 180?后 ，重新插入到原來染色體的原位臵上 ， 從而使其基因順序與其它的基因順序相反； 易位 是指斷裂下來的一小段染色體再順向或逆向地插入到同一條染色體的其它部位上 。 染色體間畸變：指非同源染色體間的 易位 。 染色體畸變 轉(zhuǎn)座因子 （ transposible element） 由 40年代 B. McClintock對的遺傳研究而發(fā)現(xiàn)染色體易位 ， 自1967年以來 ， 已在微生物和其它生物中得到普遍證實 ， 并已成為分子遺傳學(xué)研究中的一個熱點 。 舊概念 ： 基因是固定在染色體 DNA上的一些不可移動的核苷酸片段 。 新發(fā)現(xiàn) ： 有些 DNA片段不但可在染色體上移動 ， 還可從一個染色體跳到另一個染色體 ， 從一個質(zhì)粒跳到另一個質(zhì)?；蛉旧w ，甚至還從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞 。 在這些 DNA順序的跳躍過程中 ， 往往導(dǎo)致 DNA鏈的斷裂或重接 ， 從而產(chǎn)生重組交換或使某些基因啟動或關(guān)閉 ， 結(jié)果導(dǎo)致突變的發(fā)生 。 轉(zhuǎn)座因子 （ transposible element） ： 在染色體組中或染色體組間能改變自身位臵的一段 DNA順序 。 也稱作跳躍基因（ jumping gene） 或可移動基因 （ movable gene） 。 自發(fā)突變： 是指在沒有人工參與下生物體自然發(fā)生的突變 。 幾種自發(fā)突變的可能機(jī)制 ★ 微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)： 過氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物 。 它對Neurospora（ 脈孢菌 ） 有誘變作用 ， 這種作用可因同時加入過氧化氫酶而降低 ， 如果在加入該酶的同時又加入酶抑制劑 KCN， 則又可提高突變率 。 這就說明 ， 過氧化氫很可能是 “ 自發(fā)突變 ” 中一種內(nèi)源性誘變劑 。 在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株 ， 可能也是同樣的原因 。 （ 六 ） 紫外線對 DNA的損傷及其修復(fù) 已知的 DNA損傷類型很多 ， 機(jī)體對其修復(fù)的方式也各異 。 發(fā)現(xiàn)較早和研究得較深入的是紫外線 （ .，ultraviolet ray） 的作用 。 嘧啶 對紫外線的敏感性要比嘌呤強(qiáng)得多 。 嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物 。 其中了解較清楚的是 胸腺嘧啶二聚體 的形成和消除 。 紫外線的主要作用是使 同鏈 DNA的相鄰嘧啶 間 形成共價結(jié)合的 胸腺嘧啶二聚體 。 二聚體的出現(xiàn)會減弱雙鏈間氫鍵的作用 ， 并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形 ， 阻礙堿基間的正常配對 ，從而有可能引起突變或死亡 。 在互補(bǔ)雙鏈間形成嘧啶二聚體的機(jī)會較少 。 但一旦形成 ， 就會妨礙雙鏈的解開 ， 因而影響 DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄 ， 并使細(xì)胞死亡 。 光復(fù)活作用 （ photoreactivation） 定義 ：經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下時 ， 可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象 ， 稱為光復(fù)活作用 。 經(jīng)紫外線照射后形成的帶有胸腺嘧啶二聚體的 DNA分子 ， 在黑暗下會被一種 光激活酶 （ photoreactivating enzyme） 即光裂合酶 （ photolyase） 結(jié)合 ， 當(dāng)形成的復(fù)合物暴露在可見光 （ 300~500nm） 下時 ， 此酶會因獲得光能而發(fā)生解離 ， 從而使二聚體重新分解成單體 。 由于一般的微生物中都存在著光復(fù)活作用 ， 所以進(jìn)行紫外線誘變育種時 ， 只能在紅光下照射及處理照射后的菌液 。 切除 復(fù)作用 （ excision repair） 又稱 暗修修復(fù) （ dark repair） 。 是活細(xì)胞內(nèi)一種用于修復(fù)被紫外線等誘變劑 （ 包括烷化劑 、 X射線和 γ射線等 ） 損傷后的 DNA的機(jī)制 。 這種修復(fù)作用與光無關(guān) 。 有四種酶參與 —— ① 內(nèi)切核酸酶 ； ② 外切核酸酶 ； ③ DNA聚合酶 ； ④ 連接酶 。 暗修復(fù)作用 （ dark repair） 由 核酸內(nèi)切酶 切開二聚體的 5’末端，形成 3’OH和 5’ P的單鏈缺口 核酸外切酶 從 5’ P到 3’OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口。 DNA聚合酶 以另一條互補(bǔ)鏈為模板，從原有鏈上暴露的3’OH端起合成缺失片段。 連接酶 將新合成的 3’OH與原有的 5’ P相連接。 紫外誘變方法 : 設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等， 紫外燈：波長為 25 7nm, 功率是 15W 處理時的照射距離： 20cm — 30cm 樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過 3mm 照射時，要用 磁力攪拌器攪拌。 處理劑量：常用照射時間或死亡率作為相對劑量。 由于微生物接受的照射劑量與燈的功率、照射距離、照射時間、菌液濃度、菌液厚度、細(xì)胞本身特性等因素有關(guān)，所以單純用時間表示照射劑量并不完全可靠。一定的死亡率必定對應(yīng)一定的照射劑量，所以，在實際應(yīng)用中，用死亡率表示照射劑量更可靠。 通常先繪制照射時間與死亡率的關(guān)系曲線，然后選擇合適的劑量。 生產(chǎn)上經(jīng)常采用的劑量： 死亡率為 70%——80%左右。 誘變育種： 是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì) （ DNA） 的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變 ， 引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法 。 ? 誘變育種具有極其重要的實踐意義 。 當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株 ， 幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的 。 （七）突變與育種 自發(fā)突變與育種 （ 1） 誘變育種的步驟： 原始菌種 純化 斜面 /肉湯培養(yǎng) 單孢子 /單細(xì)胞懸液 誘變劑處理 平板分離 移至斜面 小試 中試 初篩 復(fù)篩 計算存活率 觀察形態(tài)變異，挑單菌落 良種保藏 原菌種特性鑒定 誘變育種的基本過程： 選擇選擇合適的出發(fā)菌株 ↓ 制備待處理的菌懸液 ↓ 誘變處理 ↓ 篩選 ↓ 保藏和擴(kuò)大試驗 誘變育種的幾個原則： 選擇簡便有效的誘變劑； 挑選優(yōu)良的出發(fā)株； 處理單細(xì)胞或單孢子懸液； 選擇最適的誘變劑量； 充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)； 利用和創(chuàng)造形態(tài) 、 生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)； 設(shè)計高效篩選方案； 創(chuàng)造新型篩選方法 。 ： 出發(fā)菌株 ———用來 育種處理的 起始菌株 ◆ 出發(fā)菌株應(yīng)具備： ①對誘變劑的敏感性高； ② 具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力； ◆ 出發(fā)菌株的來源； ①自然界直接分離到的野生型菌株： ②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗的菌株： ③已經(jīng)歷多次育種處理的菌株： 要求： ①菌體處于對數(shù)生長期，并使細(xì)胞處于同步生長； ②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞，以避免 表型遲延現(xiàn)象（ phenotypic lag） 。 方法： ① 玻璃珠打散 1015min。 ② 加０ .3%吐溫 80（表面活性劑） ③用無菌脫脂棉過濾。 制備： 物理誘變劑 ——生理鹽水（ %NaCl) 化學(xué)誘變劑 ——緩沖液 濃度： 細(xì)菌、放線菌 108個 /ml 霉菌、酵母菌 106個 /ml 表型遲延現(xiàn)象 :指某一突變在 DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才在表型上顯示出來，造成不純的菌落。 產(chǎn)生原因： ①分離性遲延現(xiàn)象 ②生理性遲延現(xiàn)象 ： 誘變劑的作用： ①提高突變的頻率 ②擴(kuò)大產(chǎn)量變異的幅度 ③使產(chǎn)量變異朝著正突變或負(fù)突變移動 劑量的表示法 ：不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。 —致死率是最好的誘變劑相對劑量的表示方法。 最適劑量的選擇 ：產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在 70~80%） ? 選擇誘變劑的種類 ：在選用理化因子作誘變劑時 ， 在同樣效果下 ， 應(yīng)選用 最方便 的因素；而在同樣方便的情況下 ，則應(yīng)選擇 最高效 的因素 。 在物理誘變劑中 ， 尤以 紫外線為最方便 ， 而在化學(xué)誘變劑中 ， 一般可選用誘變效果最為顯著的 “ 超誘變劑 ” ， 如 NTG。 ? 簡便有效的誘變方法： 紫外線的照射最為方便 。 化學(xué)誘變劑的種類 、 濃度和處理方法尤其是中止反映的方法很多 ， 實際工作時可參看有關(guān)書籍 。 一種較有效的簡易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細(xì)胞 ， 然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒 （ 也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片 ） ， 經(jīng)培養(yǎng)后 ， 在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落 ， 分別制成懸浮液 ， 然后將其涂在一般平板表面使長出許多單菌落 ， 最后可用影印培養(yǎng)法或逐個檢出法選出突變種 。 誘變處理方式： 單一因子處理： 復(fù)合因子處理： 兩種以上因素 先后使用 同時使用 單一因子重復(fù)使用 4. 菌種篩選 篩選方案： ? 實際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行。 ? 初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)； ——因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應(yīng)盡可能快速、簡單。 ? 復(fù)篩的目的：確認(rèn)符合要求的菌株； ——復(fù)篩以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。 篩選是 最為艱難的也是最為重要 的步驟 . 可見，設(shè)計和采用效率高的篩選方案和方法極其重要。 以選育高產(chǎn)突變株為例，誘變育種的基本環(huán)節(jié)概括如下： 第一輪： 一個出發(fā)菌株 →→→選出 200個菌株 →→→選出 50株 →→→選出 5株 誘變處理 初篩 （每瓶一株）