【正文】 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時，它可以單獨(dú)轉(zhuǎn)移，也可以攜帶著染色體（片段）一起進(jìn)行轉(zhuǎn)移，所以它可成為基因工程的載體。 MTV HRV HRV MTV 上述結(jié)果說明 ， 在 RNA病毒中 ， 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸 。 將 TMV在一定濃度的 苯酚 溶液中振蕩 ， 就能將其蛋白質(zhì)外殼與 RNA核心相分離 。 熱死 SIII菌 —————不生長 活 RII 菌 —————長出 RII菌 熱死 SIII菌 —————長出大量 RII菌和 106SIII菌 活 R菌 +S菌無細(xì)胞抽提液 ——長出大量 R菌和少量 S菌 +活 RII菌 平皿培養(yǎng) ① 加 S菌 DNA ② 加 S菌 DNA及 DNA酶以外的酶 ③ 加 S菌的 DNA和 DNA酶 ④ 加 S菌的 RNA ⑤ 加 S菌的蛋白質(zhì) ⑥ 加 S菌的莢膜多糖 活 R菌 長出 S菌 只有 R菌 1944年 、 M. McCarty從熱死 S型 S. pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分 ， 并在離體條件下進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)： 只有 S型細(xì)菌的 DNA才能將 S. pneumoniae的 R型轉(zhuǎn)化為 S型 。 20多種氨基酸經(jīng)過不同排列組合 ， 可以演變出的蛋白質(zhì)數(shù)目幾乎可以達(dá)到一個天文數(shù)字 ， 而核酸的組成卻簡單得多 ， 一般僅由4種不同的核苷酸組成 ， 它們通過排列核組合只能產(chǎn)生較少種類的核酸 ， 因此當(dāng)時認(rèn)為決定生物遺傳型的染色體和基因 ，起活性成分是蛋白質(zhì) 。 遺傳與變異的概念 第一節(jié) 遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ) 遺傳物質(zhì)是什么 ？ 種質(zhì)連續(xù)理論 ： 1883~1889年間 Weissmann提出 。 飾變 （ modification） ： 指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄 、 轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化 。 遺傳型 + 環(huán)境條件 表型 表型 （ phenotype） ： 指生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和 。 對微生物遺傳規(guī)律的深入研究 ， 不僅促進(jìn)了 現(xiàn)代分子生物學(xué) 和 生物工程學(xué) 的發(fā)展 ， 而且為 育種工作 提供了豐富的理論基礎(chǔ) ， 促使育種工作從不自覺到自覺 、 從低效到高效 、 從隨機(jī)到定向 、 從近緣雜交到遠(yuǎn)緣雜交的方向發(fā)展 。 研究微生物遺傳學(xué)的意義 : 第八章 微生物的遺傳變異與育種 遺傳與變異的概念 遺傳和變異是生物體的最本質(zhì)的屬性之一 。是一種 現(xiàn)實(shí)存在 ， 是具一定遺傳型的生物在一定條件下所表現(xiàn)出的具體性狀 。 特點(diǎn)是： 中的每一個個體都發(fā)生同樣的變化； ； c.因遺傳物質(zhì)不變 ， 故飾變是不遺傳的 。 認(rèn)為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結(jié)構(gòu)的化合物 。 DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的證明 ： 1944年以后 ， 先后有利用微生物為實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行的三個著名實(shí)驗(yàn)的論證： 肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)； 噬菌體感染試驗(yàn)； 病毒的拆開與重建試驗(yàn) 。 且 DNA純度越高 ， 轉(zhuǎn)化效率也越高 。 分離后的 RNA在沒有蛋白質(zhì)包裹的情況下 ， 也能感染煙草并使其患典型癥狀 ， 而且在病斑中還能分離出正常病毒粒子 。 ?（一）核酸存在的七個水平 ?細(xì)胞水平：存在于細(xì)胞核或核質(zhì)體，單核或多核 ?細(xì)胞核水平 : 原核與真核生物的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不同，核外 DNA ?染色體水平 : 倍性 (真核 )和染色體數(shù) ?核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或 RNA，復(fù)合或裸露，雙鏈或單鏈 ?基因水平：具自主復(fù)制能力的遺傳功能單位，長度與信息量， 轉(zhuǎn)錄 ——翻譯 ?密碼子水平： 信息單位，起始和終止 ?核苷酸水平： 突變或交換單位，四種堿基 二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式 （ 二 ） 原核生物的質(zhì)粒 定義 ：是一類小型閉合環(huán)狀核外雙螺旋 DNA分子 ， 能獨(dú)立于細(xì)胞 核進(jìn)行自主復(fù)制 。 ④ 對于細(xì)菌的生存并不是必要的 ⑤ 功能多樣化 功能 ：進(jìn)行細(xì)胞間接合，并帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等。 存在于腸細(xì)菌屬 、 假單胞菌屬 、 嗜血桿菌 、 奈瑟氏球菌 、 鏈球菌等細(xì)菌中 ， 決定性別 。 –R因子在細(xì)胞內(nèi)的 copy數(shù)可從 1~2個到幾十個，分為嚴(yán)緊型和松弛型兩種，經(jīng)氯霉素處理后，松弛型質(zhì)粒可達(dá)2022~3000個 /細(xì)胞。 大腸桿菌素都是由 Col因子編碼的 。它們的降解性質(zhì)?？蔀橐幌盗心芙到鈴?fù)雜物質(zhì)的酶編碼，從而能利用一般細(xì)菌所難以分解的物質(zhì)做碳源。 當(dāng)細(xì)菌侵入植物細(xì)胞中后 ，在其細(xì)胞中溶解 ， 把細(xì)菌的 DNA釋放到植物細(xì)胞中 。 一些具有重要性狀的外源基因可借 DNA重組技術(shù)設(shè)法插入到 Ti質(zhì)粒中 ， 并進(jìn)一步使之整合到植物染色體上 ， 以改變該植物的遺傳性 ， 達(dá)到培育植物優(yōu)良品種的目的 。 起始密碼子 ： AUG， 甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸 終止密碼子 ： UAA、 UGA、 UAG 核外 DNA的種類 核外染色體 真核生物的 “ 質(zhì)粒 ” 原核生物的 質(zhì)粒 線粒體 細(xì)胞質(zhì)基因 葉綠體 （ 質(zhì)體 ） 中心體 動 體 共生生物： 卡巴顆粒 酵母菌的 2?m質(zhì)粒 F因子 R因子 Col質(zhì)粒 Ti質(zhì)粒 巨大質(zhì)粒 降解性質(zhì)粒 第二節(jié) 基因突變和誘變育種 突變 （ mutation ） ： 指生物體的表型突然發(fā)生的可遺傳的變化 染色體畸變 ——細(xì)胞學(xué)上可以看到染色體的變化 突變 基因突變 ——細(xì)胞學(xué)上看不到遺傳物質(zhì)的變化 突變體 （ mutant） ：發(fā)生了突變的微生物細(xì)胞或菌株 野生型 （ wild type） ：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生 突變前的原始菌株 ★ 依表型的改變分為： 營養(yǎng)缺陷型 ——因突變而喪失產(chǎn)生某種生物合成酶的能力 ， 并因而 成為必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長的突變類型 。 例如 ， 突變率為 10–8是指該細(xì)胞在一億次細(xì)胞分裂中 ， 會發(fā)生一次突變 。 某一基因發(fā)生突變 不會影響其它基因 的突變率 。 ?自發(fā)性 ：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生 。 ?穩(wěn)定性 ：變異性狀穩(wěn)定可遺傳 。 一種觀點(diǎn) 認(rèn)為 ， 突變是通過適應(yīng)而發(fā)生的 ， 即各種抗性是由其環(huán)境 （ 指其中所含的抵抗對象 ） 誘發(fā)出來的 ， 突變的原因和突變的性狀間是相對應(yīng)的 ， 并認(rèn)為這就是 “ 定向變異 ” ， 也有人稱它為 “ 馴化 ” 或 “ 馴養(yǎng) ” 。 變量試驗(yàn)又稱 波動 試驗(yàn)或 彷徨 試驗(yàn) 。 涂布試驗(yàn)中突變率的計算 初始接種量： 5 104 個 /皿 培養(yǎng) 5小時 ， 繁殖了 ， 每個微菌落約含 5100個細(xì)菌 這時 ， 每個平皿上的細(xì)胞數(shù)為： 5100 5 104 ≈ 108個 /皿 在 6個平板上 ， 比接種時增加的細(xì)胞數(shù)為： 6 （ 108 ? 5 104） = 108 在未涂布的平板上共發(fā)現(xiàn) 28個突變 ， 故 突變率 = 28/ 108 = 10?8 3. 平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)（ replica plating） 1952年 ， J. Lederberg夫婦的論文 《 平板影印培養(yǎng)法和細(xì)菌突變株的間接選擇 》 ， 更好地證明了微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發(fā)地產(chǎn)生的 ， 這一突變與相應(yīng)藥物環(huán)境毫不相干 。 平板影印培養(yǎng)法 在根本未接觸過任何一點(diǎn)鏈霉素的情況下，就可以篩選到大量抗鏈霉素的突變株，充分說明了突變是自發(fā)產(chǎn)生的，鏈霉素只是起到了一種檢出作用。 種類 ：誘變劑的種類很多 ， 作用方式多樣 。 它只涉及一對堿基被另一對堿基所臵換 。 ★ 直接引起臵換的誘變劑 定義 ：一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的誘變劑 ， 不論在機(jī)體內(nèi)或是在離體條件下均有作用 。 羥胺只引起 G┇ C→A : T， 其余都是可使 G┇ C=A : T發(fā)生互變的 。 與染色體畸變相比 ， 移碼突變也只能算是DNA分子的微小損傷 。 丫啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示： （ 3） 染色體畸變 （ chromosomal aberration） 某些強(qiáng)烈理化因子 ， 如 X射線 等的輻射及 烷化劑 、亞硝酸 等 ， 除了能引起點(diǎn)突變外 ， 還會引起 DNA的大損傷 （ macrolesion） ——染色體畸變 ， 它包括： 染色體結(jié)構(gòu)上的變化： 缺失 （ deletion） ； 重復(fù) （ duplication） ； 易位 （ translocation） ； 倒位 （ inversion） ； 染色體數(shù)目的變化 。 染色體間畸變：指非同源染色體間的 易位 。 在這些 DNA順序的跳躍過程中 ， 往往導(dǎo)致 DNA鏈的斷裂或重接 ， 從而產(chǎn)生重組交換或使某些基因啟動或關(guān)閉 ， 結(jié)果導(dǎo)致突變的發(fā)生 。 幾種自發(fā)突變的可能機(jī)制 ★ 微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)： 過氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物 。 （ 六 ） 紫外線對 DNA的損傷及其修復(fù) 已知的 DNA損傷類型很多 ， 機(jī)體對其修復(fù)的方式也各異 。 其中了解較清楚的是 胸腺嘧啶二聚體 的形成和消除 。 但一旦形成 ， 就會妨礙雙鏈的解開 ， 因而影響 DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄 ， 并使細(xì)胞死亡 。 切除 復(fù)作用 （ excision repair） 又稱 暗修修復(fù) （ dark repair） 。 暗修復(fù)作用 （ dark repair） 由 核酸內(nèi)切酶 切開二聚體的 5’末端，形成 3’OH和 5’ P的單鏈缺口 核酸外切酶 從 5’ P到 3’OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口。 處理劑量：常用照射時間或死亡率作為相對劑量。 生產(chǎn)上經(jīng)常采用的劑量： 死亡率為 70%——80%左右。 （七）突變與育種 自發(fā)突變與育種 （ 1） 誘變育種的步驟： 原始菌種 純化 斜面 /肉湯培養(yǎng) 單孢子 /單細(xì)胞懸液 誘變劑處理 平板分離 移至斜面 小試 中試 初篩 復(fù)篩 計算存活率 觀察形態(tài)變異，挑單菌落 良種保藏 原菌種特性鑒定 誘變育種的基本過程： 選擇選擇合適的出發(fā)菌株 ↓ 制備待處理的菌懸液 ↓ 誘變處理 ↓ 篩選 ↓ 保藏和擴(kuò)大試驗(yàn) 誘變育種的幾個原則： 選擇簡便有效的誘變劑； 挑選優(yōu)良的出發(fā)株； 處理單細(xì)胞或單孢子懸液； 選擇最適的誘變劑量； 充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)； 利用和創(chuàng)造形態(tài) 、 生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)； 設(shè)計高效篩選方案； 創(chuàng)造新型篩選方法 。 制備： 物理誘變劑 ——生理鹽水（ %NaCl) 化學(xué)誘變劑 ——緩沖液 濃度： 細(xì)菌、放線菌 108個 /ml 霉菌、酵母菌 106個 /ml 表型遲延現(xiàn)象 :指某一突變在 DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才在表型上顯示出來，造成不純的菌落。 在物理誘變劑中 ， 尤以 紫外線為最方便 ， 而在化學(xué)誘變劑中 ， 一般可選用誘變效果最為顯著的 “ 超誘變劑 ” ， 如 NTG。 誘變處理方式： 單一因子處理： 復(fù)合因子處理： 兩種以上因素 先后使用 同時使用 單一因子重復(fù)使用 4. 菌種篩選 篩選方案： ? 實(shí)際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行。 以選育高產(chǎn)突變株為例，誘變育種的基本環(huán)節(jié)概括如下： 第一輪： 一個出發(fā)菌株 →→→選出 200個菌株 →→→選出 50株 →→→選出 5株 誘變處理 初篩 （每瓶一株） 復(fù)篩 （每瓶四株） 第二輪： 5個出發(fā)菌株 →→→ →→ → 選出 50株 →→ →選出 5株 40株 40株 40株 40株 40株 誘變處理 初篩 復(fù)篩 （每瓶一株） （每瓶四株） 變異菌的一般篩選方法 平皿快速檢測法 ? 變色圈法 ? 透明圈法 ? 生長圈法