【文章內容簡介】 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 53 藥物對沙門菌的影響 ? 此外，由于藥品在生產過程中，常受到加熱、干燥等加工步驟的影響，藥品中污染的沙門菌可受到損傷或呈休眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先進行預增菌。然后再進行增菌及分離、三糖鐵瓊脂初步鑒別、生化試驗、血清學試驗等步驟。其他控制菌也可能存在相同狀況 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 54 2 對照用菌液 ? 乙型副傷寒沙門菌 〔 CMCC(B)50094〕 的營養(yǎng)瓊脂 ? 斜面培養(yǎng)物少許，接種至 5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內。 36177。 1℃ 培養(yǎng) 18～ 24h后，用 %無菌氯化鈉溶液釋至 1： 106，濃度相當于 50100個 cfu/ 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 55 3 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 56 ? 預增菌 取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 3瓶，每瓶各100ml， 2瓶加入 1： 10供試液各 10ml，其中 1瓶加入對照菌液 (含菌量為 50～ 100個 cfu/ml)作陽性對照，第 3瓶加入稀釋劑 10ml作陰性對照，培養(yǎng) 18～ 24h后觀察。搖動陰性對照瓶后應清亮透明，無菌生長，否則試驗無效 ? 增菌培養(yǎng) 輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶及陽性對照培養(yǎng)瓶，分別吸取 1ml各接種于 1管四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 18～ 24h。陽性對照管 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 57 分離培養(yǎng) ? 輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶和陽性對照增菌培養(yǎng)瓶，以接種環(huán)分別沾取 1～ 2環(huán)培養(yǎng)液接種于膽鹽硫乳瓊脂 (DHL)或沙門菌志賀菌瓊脂 (SS)平板及曙紅亞甲藍 (EMB)瓊脂或麥康凱瓊脂平板各 1個，倒置培養(yǎng) 24～ 48h。檢查平板上有無疑似沙門菌菌落 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 58 沙門菌在分離平板上的菌落 平板 沙門菌屬亞屬 ⅠⅡⅣⅤ 沙門菌亞屬 Ⅲ 膽鹽硫乳瓊脂(DHL) 無色或微帶橙色 ， 透明或半透明 ，邊緣整齊 、 光滑 、 中等大小或較小 ，產 H2S的菌落中心或幾乎全黑色 ， 中心帶黑色 ，ⅠⅡⅣⅤ 同 沙門菌屬志賀菌屬瓊脂 () 無色或微帶粉色 ， ，邊緣整齊 、 光滑 ， 中等大小或較小 ，產 H2S的菌落 ， 中心呈黑色 。 同一平板上常有多數(shù)菌落無黑色中心 同膽鹽硫乳瓊脂平板 。 但發(fā)酵乳糖無黑色中心的菌落與大腸埃希菌不能區(qū)別 曙紅亞甲藍瓊(EMB) 無色或微帶橙色 ， 透明或半透明 ，中等大小 ， 邊緣整齊光滑 發(fā)酵乳糖的菌株菌落為紫色 。 遲緩發(fā)酵乳糖或不發(fā)酵乳糖的菌株與沙門菌亞屬 ⅠⅡⅣⅤ 同 (MacC) 同曙紅亞甲藍瓊脂平板 發(fā)酵乳糖的菌株菌落為粉紅色 ，不發(fā)酵乳糖或遲緩發(fā)酵乳糖的菌株與沙門菌亞屬 ⅠⅡⅣⅤ 同 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 59 菌落特征補充 ? 由于沙門菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產酸，菌落不著色，一般為無色半透明，多數(shù)沙門菌因產生 H2S，菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，在 DHL瓊脂平板上較為明顯 ? 在 SS瓊脂平板上， H2S特征有時不明顯，沙門菌屬亞屬 Ⅲ因多數(shù)菌株發(fā)酵乳糖，故在上述平板上的乳糖發(fā)酵菌落呈現(xiàn)粉紅或紫色，但由于產生 H2S，在有 H2S指示系統(tǒng)的平板上仍出現(xiàn)黑色中心 ? 在上述培養(yǎng)基上，有些非沙門菌屬細菌，也可呈現(xiàn)類似沙門菌菌落形態(tài)，須進一步鑒別 ? 陽性對照平板上，應有沙門菌落形態(tài)特征的菌落生長，否則，應查明原因。若為供試品抑菌成分所致，須重新制備供試液，消除抑菌成分影響后再行檢查 ? 由于藥物的影響或非典型菌株的存在，沙門菌菌落可呈現(xiàn)非典型形態(tài)，如色澤變深，菌落粗糙等，應注意辨別 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 60 ? 如陽性對照平板有典型菌落生長，供試品平板均未生長或無疑似菌落生長，則報告1g或 1ml供試品未檢出沙門菌 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 61 菌落傳純 ? 從每個供試品的分離平板上挑取 2～ 3個疑似菌落 (無色或微帶橙色，產 H2S的菌落；無色或微帶橙色、不產 H2S的菌落；紅色，產H2S的菌落 )分別接種于三糖鐵瓊脂斜面，接種時應以接種針輕輕接觸單個菌落中心部位，沾取培養(yǎng)物劃線于三糖鐵瓊脂斜面（或者克氏雙糖鐵瓊脂斜面，制備可以查閱相關工具書）并穿刺到底層或先穿刺底層再劃線斜面，培養(yǎng) 24177。 2h，觀察結果 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 62 4 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 63 三糖鐵瓊脂反應 ? 疑似沙門菌在三糖鐵瓊脂斜面上的反應 ? ①斜面紅色 (產堿 )，底層黑色 (產 H2S)并顯示黃色 (產酸 )； ? ②斜面紅色，底層黃色； ? ③斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。 ? 多數(shù)沙門菌在三糖鐵瓊脂上產生氣體，使底層瓊脂出現(xiàn)氣泡或使瓊脂斷裂，但也有不產生氣體的菌種。 ? 對在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時底層無黑色，或斜面及底層均為紅色者可以排除沙門菌。 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 64 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 65 有關細菌在三糖鐵瓊脂上的反應 斜面 底層產氣 硫 化氫 + + + + 沙門菌屬 + + + + + 沙門菌屬Ⅲ2 + + + + + 沙 門 菌 屬 ， 緩 慢愛德華菌屬 +/ + + + + + 弗 勞 地 檸 檬 酸 桿菌 + +s + + + 奇異變形桿菌4 + +/s+ + + + 普通變形桿菌 + + + + + 大腸埃希菌 + + + 沙 門 菌 屬 、 大 腸埃希菌 + 志賀菌屬 + + /+ /+ +/ +/ 大腸埃希菌 + + /+ 大腸埃希菌 + + 志 賀 菌 屬 、 大 腸埃希菌 + + + +/ + 陰溝腸桿菌 +/ + +/ /+ + + 肺 炎 克 雷 伯 菌 、產 氣 腸 桿 菌 、 蜂窩 哈 夫 尼 亞 菌 、粘質沙門菌8 + +s/ + +/ + 普 羅 菲 登 斯 菌 屬、摩根菌屬氰化鉀賴氨酸脫羧酶判定菌屬序號三糖鐵瓊脂 靛基質脲酶2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 66 脲酶試驗 ? 用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，劃線接種于脲瓊脂斜面，培養(yǎng) 4及 24h，觀察結果。紅色為陽性反應，沙門菌屬為陰性反應，與變形桿菌相區(qū)別 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 67 氰化鉀試驗 ? 將培養(yǎng)物先接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，用接種環(huán)沾取培養(yǎng)液 1環(huán)，接種至氰化鉀培養(yǎng)基內，另取一環(huán)培養(yǎng)液接種于不含氰化鉀的同樣培養(yǎng)基內作對照管，接種后即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng) 24～ 48h，觀察結果。對照管內有菌生長 (混濁 )，而試驗管也有菌生長為陽性反應；對照管有菌生長(混濁 )而試驗管無菌生長 (清亮 )為陰性反應。沙門菌應為陰性反應 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 68 ? 本試驗應十分注意密封管口，夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進行，防止氰化鉀分解，產生氫氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內氰化鉀濃度降低，不能抑制細菌生長，造成假陽性。氰化鉀為劇毒品、操作時須謹慎，切勿用口吸液。用后的培養(yǎng)基每管加數(shù)粒硫酸亞鐵和 20%氫氧化鉀 。然后再滅菌、洗滌 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 69 賴氨酸脫羧酶試驗 ? 用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種在賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基中，同時接種一支不含賴氨酸的同樣培養(yǎng)基作為對照管，培養(yǎng) 24～ 48h觀察結果。對照管黃色 (產酸 )，試驗管呈紫色為陽性反應 (賴氨酸脫羧產堿 )；試驗管黃色為陰性反應。沙門菌應為陽性反應 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 70 動力試驗 ? 用接種針沾取培養(yǎng)物，穿刺接種于半固體營養(yǎng)瓊脂管中，培養(yǎng) 24h，觀察結果。有動力的細菌能在穿刺線以外的培養(yǎng)基內擴散生長使培養(yǎng)基呈混濁現(xiàn)象；無動力的細菌僅能沿穿刺線生長，不向外擴散，培養(yǎng)基仍呈清晰透明狀；無動力表現(xiàn)的培養(yǎng)物，應在室溫保留 2～ 3天后，再行觀察。沙門菌除雞雛沙門菌及無動力的變種外，均具有周身鞭毛，能運動 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 71 靛基質試驗 ? 用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種到蛋白胨水培養(yǎng)基中，照大腸桿菌檢查法靛基質試驗項下操作、判斷結果。沙門菌應為陰性反應 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 72 5 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 73 ? 準備 1片潔凈的滅菌載玻片，在近中央的一端，以直徑 3mm接種環(huán)沾取 0多價 1血清 2～ 3環(huán)制成與玻片橫徑相垂直的條形涂沫，長約 ，寬約 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 74 ? 用接種環(huán)挑取三糖鐵瓊脂斜面或營養(yǎng)瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物少許，在血清中混勻。菌量要適當，勿過濃 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 75 凝集反應的觀察 ? 將玻片前后傾斜數(shù)次，以暗色背景襯底，在良好的照明條件下進行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象都是陽性反應。陽性反應通常在 3min內發(fā)生。有時因血清效價低、反應遲緩時，應將玻片置培養(yǎng)皿內，并放一個濕棉球在旁邊，蓋上皿蓋，經約 20mi