【文章內(nèi)容簡介】 發(fā)菌株選擇應考慮的問題 ? 出發(fā)菌株的穩(wěn)定性 ? 選用具備優(yōu)良特性的菌株 ? 挑選對誘變劑敏感的菌株 ? 注意菌株的生理狀態(tài)及生長發(fā)育時間 出發(fā)菌株 ? 野生菌株 ? 自發(fā)突變后獲得的高產(chǎn)菌株 ? 已經(jīng)誘變過的菌株 ? 考慮試驗菌株的遺傳背景：各種誘變劑有不同的作用機制，一種誘變劑的作用常主要集中在DNA的某些特異部位上，多次反復用一種誘變因子易出現(xiàn) “飽和”或恢復突變現(xiàn)象，因此誘變時常采用多種不同的誘變因子或復合誘變因子。 誘 變 劑 的 選 擇 菌懸液的制備 單細胞懸浮液： 106個 /mL 孢子懸浮液： 108個 /mL 誘變：預實驗確定適宜的誘變條件 篩選：選擇合適的篩選方法 紫外線的誘變育種 ? 紫外線誘變一般采用 15W紫外線殺菌燈 ， 波長為 2537A． 燈與處理物的距離為 15～ 30cm，照射時間依菌種而異 ， 一般為幾秒至幾十分鐘 。 一般我們常以細胞的死亡率表示 ， 希望照射的劑量死亡率控制在 70～ 80%為宜 。 ? 被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為 106個／ ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為 106～ 107個／ ml。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約 ～ ，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。 ?由于紫外線照射后有光復活效應，所以照射時和照射后的處理應在紅燈下進行。 三、 雜交育種 兩個不同基因型的菌株通過結(jié)合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離和篩選出具有新性狀的菌株。 雜交可以使雙親的基因重新組合，形成各種不同的類型；基因重組可以將雙親控制不同性狀的優(yōu)良基因結(jié)合于一體，或?qū)㈦p親中控制同一性狀的不同微效基因積累起來，產(chǎn)生在各該性狀上超過親本的類型。 細菌的雜交 ? 細菌的雜交行為是于 1946年首次在大腸桿菌 K12菌株中發(fā)現(xiàn)并證實的。 ? 首先在大腸桿菌 K12菌株中誘發(fā)一個營養(yǎng)缺陷型 (A)、不能發(fā)酵乳糖 (Lac)和抗鏈霉素 (SMr)以及對噬菌體 T l敏感的突變體，可以寫成 AB+LacSMrTs1； ? 另一菌株誘發(fā)成一個營養(yǎng)缺陷型 (B)，能發(fā)酵乳糖(Lac+)，對鏈霉菌敏感 (SMs)和抗噬菌體 T l的突變體A+BLac+SM sTr1。 ?這兩個菌株各自都不能在基本培養(yǎng)基上生長，如果把大約 105 /ml濃度的上述兩種菌株混合在一起，并接種在 基本培養(yǎng)基 上，則能長出少數(shù)菌落；如果把上述兩種菌株分別接種到一個特制的 U型管的兩端去培養(yǎng) ,中間用一片可以使培養(yǎng)液流通 ,但不能使細菌通過的燒結(jié)玻璃隔開 ,那么在基本培養(yǎng)基上就不會出現(xiàn)菌落。 這說 明細胞的接觸是導致基因重組的必要條件 ，即細菌通過接合完成了雜交行為。 在鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌、肺炎克氏桿菌、霍亂弧菌等許多細菌中也發(fā)現(xiàn)了接合現(xiàn)象，但是 至今未在革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)接合現(xiàn)象 。 放線菌的雜交育種 ?放線菌的基因重組于 1955年至 1957年首先在天藍鏈霉菌 中發(fā)現(xiàn)，以后在其它科、屬、種中相繼發(fā)現(xiàn)。 ?現(xiàn)在常用的放線菌雜交方法主要有三種： 混合培養(yǎng)法、平板雜交法和玻璃紙轉(zhuǎn)移法 。國外在金霉素、土霉素、新生霉素等抗生素產(chǎn)生菌的雜交育種方面都有過成功的報道。 霉菌的雜交育種 ? 霉菌的雜交育種主要是通過體細胞的核融合和基因重組，即通過準性生殖過程而不是通過性細胞的融合。 ? 霉菌的雜交育種的步驟為： 第一 選擇直接親本。 用來進行雜交的兩個野生型菌株叫 原始親本 。假設這種菌株是用來作為形成異核體的親本 ,就叫 直接親本 。作為直接親本的遺傳標記有多種，如營養(yǎng)突變型、抗藥突變型、形態(tài)突變型等。 第二是異核體的形成 。 ?在基本培養(yǎng)基上 ,強迫兩株營養(yǎng)缺陷型互補營養(yǎng)，則這兩個菌株經(jīng)過菌絲細胞間的吻合形成異核體。 第三是雙倍體的檢出 檢出雙倍體的方法有很多種，如用放大鏡觀察異核體菌落表面， 如果發(fā)現(xiàn)有野生型顏色的斑點和扇面，即可用接種針將其孢子挑出，進行分離純化，即得雜合雙倍體。 或者將大量異核體孢子分離于基本培養(yǎng)基平板上從中長出野生型原養(yǎng)性菌落，將其挑出分離純化，即得雜合雙倍體。 第四是分離子的檢出。 ?可以用選擇性培養(yǎng)基篩選分離子，也可以將雜合雙倍體單孢子分離于完全培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至菌落成熟，檢查大量雙倍體菌落，在一些菌落上有突變顏色（隱性標記）的斑點或扇面出現(xiàn)，從每個菌落接出一個斑點或扇面的孢子于完全培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)后經(jīng)過純化和鑒別即得分離子。 四、原生質(zhì)體融合 步驟： ? 標記菌株的篩選： 對兩親株要進行標記，以提高篩選率。 ? 原生質(zhì)體的制備 ：用相應的酶脫去菌體的細胞壁，制得完整的原生質(zhì)體。 ? 原生質(zhì)體的融合與再生 ：兩原生質(zhì)體在促融因子的存在下，發(fā)生融合，重建細胞壁，形成新的細胞。 ? 融合子的選擇 ：在選擇培養(yǎng)基上，通過兩個親本的遺傳標記互補而選擇融合。 特點及應用： ? 原生質(zhì)體間的雜交頻率都明顯高于常規(guī)雜交法 ，霉菌與放線菌已達 101 ~102，細菌與酵母已達 105~106。 ? 原生質(zhì)體融合受接合型或致育型的限制較小，因此 有利于不同種屬間微生物的雜交。 ? 已報道的絲狀真菌 種間 的原生質(zhì)體融合主要是曲霉屬和青霉屬； 屬間 原生質(zhì)體融合主要在酵母中實現(xiàn)：熱帶假絲酸母 飾針復膜孢酵母，釀酒酵母 彭貝裂殖酵母等。 ? 重組體 種類 較多； ? 遺傳物質(zhì)的 傳遞更完整； ? 采用溫度、藥物或紫外線照射燈處理鈍化一方的親株原生質(zhì)體，再融合，可以 提高篩選頻率 ； ? 可以把 原生質(zhì)體融合與其他育種方法結(jié)合 起來，提高篩選效率。 五、 DNA重組技術 DNA片斷的獲得 DNA分子的連接 DNA分子引入宿主細胞 DNA分子的宿主細胞 基因重組 質(zhì)粒的特點 質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動必需 。 每個細胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù) 。 不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異 ， 有嚴緊型和松弛型兩種 。 質(zhì)粒 DNA分子常呈現(xiàn) 三種 形態(tài)；常見的一種是共價 、閉環(huán)狀 DNA(CCC DNA)；其次是由于一條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán) DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性 DNA。 作為載體的質(zhì)粒的要求 ?能自主復制 ?有明顯篩選標記 ?有內(nèi)切酶酶切位點 ?以多拷貝形式存在 ?含有啟動子，有利于外源基因表達 ?能在宿主中穩(wěn)定的遺傳 質(zhì)粒 DNA的提取方法 ?細菌培養(yǎng)和質(zhì)粒擴增； ?細菌的收獲和裂解； ?質(zhì)粒 DNA的提取 。 重組 DNA中常用的工具酶 ?限制性核酸內(nèi)切酶：平頭連結(jié) （ 不常用 ） 、 黏端連結(jié) （ 常用 ） ? DNA連接酶 ? DNA聚合酶 ?逆轉(zhuǎn)錄酶等 限制性內(nèi)切酶的剪切方式 宿主細胞必須符合以下條件 ? 對載體的復制和擴增沒有嚴格的限制； ? 不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源 DNA； ? 在重組 DNA增殖過程中，不會對它進行修飾； ? 重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組； ? 容易導入重組 DNA分子； ? 符合重組 DNA操作的安全標準。 重組 DNA導入宿主菌 ? 體外連接的重組 DNA分子必須導入適當?shù)氖荏w細胞中才能大量的復制 、 增殖和表達 。 根據(jù)所采用的載體的性質(zhì) ， 將重組 DNA分子導入受體可有不同的方法 。 轉(zhuǎn) 化 ? 指以細菌質(zhì)粒為載體 ， 將外源基因?qū)胧荏w細胞的過程 。 轉(zhuǎn)化時 ， 細菌必須經(jīng)過適當?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源 DNA的狀態(tài) ， 然后利用短暫熱休克使 DNA導入細菌宿主中 。 ? 此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細菌 ， 它的優(yōu)點是操作簡便 、 轉(zhuǎn)化效率高 、 適用于任何菌株 。 轉(zhuǎn)染和感染 ? 利用噬菌體 DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導入受體菌 。