【正文】 須經(jīng)過適當?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源 DNA的狀態(tài) ，然后利用短暫熱休克使 DNA導入細菌宿主中 。 根據(jù)所采用的載體的性質(zhì) ， 將重組 DNA分子導入受體可有不同的方法 。 ? T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于： ? １ 、 連接具有同源互補粘性末端的ＤＮＡ片段； ? ２ 、 連接雙鏈 DNA分子間的平端； ? ３ 、 在雙鏈平端的 DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子 。 一、 DNA連接酶 ? DNA連接酶催化兩條雙鏈 DNA片段相鄰的 5’磷酸和 3’羥基間形成磷酸二酯鍵 。 DNA擴增 PCR反應 DNA片斷的克隆 載體的條件 ： a 復制起點 b 適宜的限制酶切點 c 選擇標記 ? DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組 DNA技術的關鍵 。 ? 使 DNA解鏈（高溫），引物結合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長）反應。 ? 三、聚合酶鏈反應法擴增基因片段 ? 對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應（ＰＣＲ），以基因組 DNA或 cDNA模板擴增得到目的基因片段?？扇コ婧松锘蛑胁槐磉_的內(nèi)含子。 目的基因的獲取 ? 一、通過建立基因文庫分離靶基因 ? 基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內(nèi)切酶。 載體應具備以下條件： ? １、能在適當?shù)乃拗骷毎袕椭疲? ? ２、具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆位點）以便外源 DNA插入； ? ３、具有篩選標志以區(qū)別陽性與陰性重組分子； ? ４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體 DNA與宿主 DNA便于分離； ? ５、對于表達型載體還應具有與宿主細胞相適應的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。 它們之間是互補的 ， 在適當條件下可以再連接一起 。 常用的遺傳轉化系統(tǒng) ? 自然系統(tǒng) ? 人工誘導（完整細胞） （ 1）二價陽離子系統(tǒng)： Ca2+， Ca2++Mg2+， Mg2+，Ca2++輔助噬菌體， Tris+Ca 2+ （ 2）單價陽離子系統(tǒng)： PEG+Li+/Cs+/Rb+ （ 3）凍融系統(tǒng) （ 4） Triton處理：人工誘導（ PEG/原生質(zhì)體） 重組 DNA中常用的工具酶 ? 包括限制性核酸內(nèi)切酶 、 DNA連接酶 、DNA聚合酶 、 逆轉錄酶等 . 限制性內(nèi)切酶 ? 切開 DNA分子所需的酶：每一種酶都有其各自的作用位點 。 13．于 37℃ 培養(yǎng)過夜。再插入冰中．加入 37℃ 靜置培養(yǎng) 90min。 10．加入 1～ 20μ l待轉化質(zhì)粒 DNA溶液。 7．加入 1ml ／ L CaCl2，再加 CaCl2，置冰浴中放置 20min。 4．當培養(yǎng)物 OD600在 ～ ，開始收獲細胞 (大約需 2～ )． 5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻 10min。 2．取 50ml肉湯中，無菌添加 ／ LMgCl2，于 37℃ 振蕩培養(yǎng)。 四、遺傳轉化 轉化是指受體細胞直接攝取供體細胞游離的DNA片段，將其同源部分進行堿基配對，組合到自己的基因中，從而獲得供體細胞的某些遺傳性狀。在實驗室條件下，質(zhì)粒也可經(jīng)人工手段將其轉化入宿主細胞內(nèi)。 質(zhì)粒載體 二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細胞的不同表現(xiàn)型 抗生素抗性：抗生素的產(chǎn)生；大腸桿菌素的產(chǎn)生；腸毒素的產(chǎn)生；復雜有機化合物的降解；限制性核酸內(nèi)切酶和修飾酶的產(chǎn)生；殺傷性能。不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異 ， 同一質(zhì)粒在不同條件下 ， 拷貝數(shù)也可能差異很大 ， 有嚴緊型和松弛型兩種 。 基因重組 一、質(zhì)粒的特點 質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動必需 。 第六節(jié) 基因育種 ? 基因重組育種：是運用體外 DNA各種操作或修改手法獲得目的基因 ， 再借助于病毒 、 細菌質(zhì)?；蚱渌d體 ， 將目的基因轉移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復制和表達 ， 或者通過細胞間的相互作用 ， 使一個細胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉移給另 — 個細胞的方法 。 ? 以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至 50℃ 的 MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿 ， 然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應位置 ， 培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長出可推知其營養(yǎng)因子 。 培養(yǎng)后會在某組合區(qū)長出 ， 就可測得所需營養(yǎng) 。 生長譜測定的方法 ? 將缺陷型菌株培養(yǎng)后 ， 收集菌體 ， 制備成細胞懸液 ， 與 MM培養(yǎng)基 (融化并涼至 50℃ )混合并傾注平皿 。 ? 此法缺點是 ， 結果有時不明確 ， 而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易 。 (三 )夾層法 ? 先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基 ， 凝固后涂上一層含菌的 MM， 凝固后再倒一薄層 MM瓊脂培養(yǎng)基 ， 培養(yǎng) 24h， 將出現(xiàn)的菌落標記 ，然后倒上一層 CM瓊脂培養(yǎng)基 ， 再培養(yǎng) 。 ? 用接種針或牙簽將 CM上長出的菌落在 MM和CM兩副平板上接種 ， 依次在相應位置點種 ，然后一起培養(yǎng) ， 觀察其生長情況 。 ? 此法要求平皿上菌落不能太多 ， 菌落之間應有一定間隔 。 ? 5． 二平皿相同方位進行比較 ， 即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長出的菌落少于 GM平板上的 。 ? 3． 將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標記的同一方位上先后輕輕一壓 ， 此菌印模即復印于上 。 ? 具體方法：影印法、點種法、夾層法 ? 1． 將一較平皿直徑小 1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨 ， 用金屬夾夾住 ， 滅菌 。 ? 菌絲過濾法：對于霉菌 ， 因孢子生長后會長出菌絲體 ， 就可用濾紙過濾法將菌絲濾去 ， 而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過 。 由于細菌或酵母對一些抗生素敏感 ， 于是就相應加入一定量的抗生素 ，結果活化狀態(tài)的野生型就被殺死 ， 保存了缺陷型 。 要研究代謝途徑 ， 育種技術都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料 。 營養(yǎng)缺陷型的用途 ? 營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學研究上用途很大 。 ? 與營養(yǎng)缺陷型對應的是野生型 。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計算出死亡率。 3．誘變處理 吸取 MNNG溶液 lml，加入到 1m1孢子懸液中， 30℃ 振蕩 30min，立即稀釋 1000倍停止作用，然后以 102， 104兩個稀釋度分離培養(yǎng)，30℃ 3天后計數(shù)。 ? (二 )操作步驟 1． 單孢子懸液制備 取斜面 ， 加入 6ml ／ L ， 用接種環(huán)刮下孢子 ， 振蕩試管 ， 立即通過帶濾紙漏斗過濾 ， 由此制得單孢子懸液 ， 若孢子液渾濁狀 ， 其孢子濃度可達 l06個／ ml， 此為待處理孢子懸液 。 其精確的作用機制尚不很清楚 ， 據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸 ， 直接作用于細胞內(nèi)的 DNA復制系統(tǒng) ， 從而誘發(fā)了變異 。 亞硝基胍誘變曲霉菌 ? N— 甲基 — N39。 6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 4．取未照射的制備菌液和照射菌液各 行稀釋分離，計數(shù)活菌細胞數(shù)。 在正式照射前 ， 應先開紫外線 10min， 讓紫外燈預熱 ， 然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射 10～ 50s。 將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾 ， 單細胞濾液裝入試管內(nèi) ， 一般處于渾濁態(tài)的細胞液含細胞數(shù)可達 108個／ ml左右 ， 作為待處理菌懸液 。 (二 )操作步驟 1． 將細菌培養(yǎng)液以 3000r／ min離心 5min， 傾去上清液 ， 將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌 。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約 ～ ，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。一般我們常以細胞的死亡率表示 ， 希望照射的劑量死亡率控制在 70～ 80%為宜 。 在以后的復篩階段 ， 還應不斷結合自然分離 ， 純化菌株 。因此在具體方法上就有差異 . 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復篩者 ， 而將 90%的菌落淘汰 。 初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的 ， 以量為主 。 這樣 ， 隱性的變異就會顯現(xiàn)出來 ， 若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng) ，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能 ， 形成混雜菌落 ，以致造成篩選結果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化 。 這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的 。 (三 )誘變處理 根據(jù)前面有關誘變劑及誘變處理的介紹 ， 結合誘變對象的實際 ， 設計誘變處理方案 。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期的細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。 5．要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 3． 每次誘變處理都有一定提高的菌株 ， 往往多次誘變能積累較多的提高 。 二、誘變育種步驟 ?出發(fā)菌株的選擇 ?處理菌懸液的制備 ?誘變處理 ?中間培養(yǎng) ?分離和篩選 (一 )出發(fā)菌株的選擇 1． 自然界新分離的野生型菌株 ， 對誘變處理較敏感 ， 容易達到好的效果 。 電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑 ， 它能造成不可回復的缺突變 。 3． 吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷 。 2． 亞硝酸和烷化劑應用的范圍較廣 ， 造成的遺傳損傷較多 。 大部分誘變劑是致癌劑 ， 所以在使用中必須非常謹慎 ， 要避免化學誘變劑與皮膚接觸 ，且切勿吸入其蒸氣 ， 有人對某些誘變劑極其敏感 ， 甚至未直接接觸就會過敏 ， 這就更要當心 。 而用電離輻射 177。 使用化學誘變劑的優(yōu)缺點： 大多數(shù)情況下 ， 就突變數(shù)量而言 ， 要比電離輻射更有效 。 化學誘變劑： 化學因子如堿基類似物 、 5— 氟尿嘧啶 、 烷化劑等 。 許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線 ，對于一般實驗室 、 中小型工廠都適用 ， 也很安全 。 ? 誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A的育種 ， 是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量 、 性能的主要手段 。 ? c. 賦予菌種對多種底物 ， 特別是價廉而豐富的底物的利用能力 ， 由此可降低操作費用 。 改進菌種的生長效率 ? 提高菌株對底物的利用率方法： ? a. 通過確定并改變代謝中的耗能部分 。 提高特定基因的表達水平 ? (1)引入強轉錄及翻譯信號 ， 可通過在一高效表達載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強啟動子；修改現(xiàn)有表達信號 ， 提高基因效力等 。 (6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制 。 (4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶 。 (2)增加前體物的濃度 。 ? 如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少 ，則多半采用隨機誘變 、 篩選及選育等技術： ? 如果對其遺傳及生物化學方面的性狀已有較深的認識 ， 則可選擇基因重組等手段進行定向育種 。 ? (3)改良菌種的評價 (包括實驗規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模 )。 工業(yè)菌種育種的方法 ? 誘變 ? 基因轉移 ? 基因重組 育種過程 ? 包括下列 3個步驟： ? (1)在不影響菌種活力的前提下 ， 有益基因型的引入 。 第三節(jié) 工業(yè)菌種的育種方針 ? 工業(yè)菌種的育種： 是運用遺傳學原理和技術對某個用于特定生物技術目的的菌株進行的多方位的改造 。 七、生產(chǎn)選種 ? 是在長年累月的生產(chǎn)實踐中 ， 在培養(yǎng)工藝條件沒有任何可見變更情況下 ， 突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大 ， 這就有可能是個別自然變異朝更好的方向變的細胞 ， 在這種條件下很適應于培養(yǎng)條件 ， 并逐漸顯示出它的生長優(yōu)勢 ， 這種優(yōu)勢的發(fā)展 ， 促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露 。 餌誘技術常用于水中真菌的富集 。 ? 植物材料中真菌的分離：植入法 ， 壓貼法 ， 洗滌法 ， 浸泡法 。在分離培養(yǎng)基中