【正文】 。 ? 成功的菌種長(zhǎng)期保藏方法之有價(jià)值的指標(biāo)包括在保藏 6個(gè)月 、 1年或更長(zhǎng)時(shí)間后存活百分率 (或存活單位 )。 ? 加速保藏試驗(yàn)可用于預(yù)測(cè)保藏過(guò)程中保藏培養(yǎng)物的穩(wěn)定性 。 ? 在保藏時(shí)定期檢測(cè)菌種活力 ， 以確定保藏培養(yǎng)物的保藏期限和保藏方法的可靠性 ， 以及確定在實(shí)際保藏過(guò)程中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性 。 ? 我們建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中 。 ? 當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí) ， 抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長(zhǎng)選擇壓 。 質(zhì)粒基因通常為宿主細(xì)胞生長(zhǎng)非必需 。 為了預(yù)防不測(cè) ， 一般保藏株 2～ 3年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn) 。 因?yàn)槟承┚暝谝后w石蠟下生長(zhǎng)還十分明顯 ， 有些菌株如某些假絲酵母還會(huì)同化液體石蠟 ， 也有的對(duì)液體石蠟保藏敏感 。 ? 浸沒(méi)保藏的操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長(zhǎng) ， 然后注入經(jīng) 170℃ 下滅菌 12h的礦物油 ， 礦物油的用量以高出培養(yǎng)物 1cm為宜 。 ? 可用于絲狀真菌 、 酵母 、 細(xì)菌和放線菌的保藏 。 ? 此方法一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長(zhǎng)期保藏方法 。 ? 因此要求在基本培養(yǎng)基上傳代為好 ， 目的是能淘汰突變株；同時(shí)轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平 。 ? 此法最為簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì) ， 且不要求任何特殊的設(shè)備 。 其他保藏方法 一、傳代保藏 二、礦物油中浸沒(méi)保藏 一、傳代保藏 ? 將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代 ， 然后在一定的生長(zhǎng)溫度下生長(zhǎng)和保存的傳代保藏方法 。 然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中 ， 或直接接種瓊脂斜面或涂布平板 。 2． 復(fù)蘇： (1)在超凈工作臺(tái)中用 70％ 酒精棉球擦洗安瓿 ， 然后用砂輪在安瓿中銼一道溝 。 (三 )凍干菌種的保藏與再生 1． 保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于 5℃ 下保藏 。 13． 關(guān)閉真空泵 。 10 ． 在真空狀態(tài)下 ， 讓安瓿保存在冷凍干燥機(jī) 中至少 16h以獲得完全干燥 。 使醇浴溫度上升至 10℃ ， 維持 2h。 6． 15min后，將歧管與真空泵相通。 將安瓿與歧管相聯(lián)后迅速置于醇浴中 ， 然后調(diào)節(jié)溫控裝置 。 4． 取下安瓿上的棉塞 ， 然后用 lml移液管分裝安瓿 (／瓿 )， 重新塞好棉塞 。 槽中裝入 2／ 3體積的異丙醇 ， 然后插入溫度計(jì)及可調(diào)溫控儀降溫探頭 ． 打開(kāi)降溫探頭控制醇浴溫度在 40℃ ， 這 — 過(guò)程約需 30min。 當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到 40℃ 時(shí)啟動(dòng)真空泵 ， 使真空度達(dá)到 ～。 而且經(jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)行冷凍保藏 ， 便于運(yùn)輸 。 ? 冷凍干燥過(guò)程中必須使用冷凍保護(hù)劑 ， 目前國(guó)內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖 ， 國(guó)外尚有運(yùn)用動(dòng)物血清等的 。 凍干保藏 ? 冷凍干燥的基本方法：是通過(guò)在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華 ， 使培養(yǎng)物干燥 。 如果無(wú)控速冷凍機(jī) ， 則一般可將安瓿或液氮瓶置于一 70℃ 冰箱中冷凍 4h， 然后迅速移入液氮罐中保存 。 (二 )液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟 1．待冷凍保藏菌種懸液的制備 (1)從生長(zhǎng)斜面制備菌懸液：每一斜面加入 5ml含10％甘油的營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液； ～ lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專(zhuān)用塑料瓶， (2)從浸沒(méi)培養(yǎng)物制備菌懸液： 在浸沒(méi)培養(yǎng)液中加入等體積 20%無(wú)菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散； 氮冷藏專(zhuān)用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于 5℃ 冰箱中 3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。 三、液氮冷凍保藏技術(shù) (一 )冷凍保護(hù)劑 在液氮冷凍保藏中 ， 最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油 ， 最終使用濃度一般為甘油 10％ 、 二甲亞砜 5％ 。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在 12℃ ／ min。 ? 在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是： ? 1． 離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞； ? 2． 用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞； ? 3． 加入等體積的 20％ 甘油或 10％ 二甲亞砜； ? 4． 混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中 ， 于 70℃ 超低溫冰箱中保藏 。 ? 這一方法雖簡(jiǎn)便易行 ， 但不適宜多數(shù)微生物的長(zhǎng)期保藏 。 ? 應(yīng)注意的是經(jīng)過(guò)一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來(lái)保藏 ?；蛘?， 將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上 ， 待生長(zhǎng)適度后 ， 將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好 ， 同上置于冰箱中保存 。 ? 冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難 。 為了獲得滿意的冷凍結(jié)果 ， 通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑 。 ? 通過(guò)冷凍 ， 使微生物代謝活動(dòng)停止 。 二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù) (1)冷凍干燥或真空干燥保藏； (2)超低溫或在液氮中冷凍保藏； (3) 轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀? (4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。 一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件 (1) 經(jīng)長(zhǎng)期保藏后菌種存活健在； (2) 保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型 ， 特別是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力 。 ? 3) 誘導(dǎo)抑制劑法：有些化合物能阻止某些誘導(dǎo)酶的合成，當(dāng)在誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)抑制劑同時(shí)存在的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)待分離菌群時(shí)，誘導(dǎo)型菌株不能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，無(wú)法正常生長(zhǎng)，只有組成型變異株能夠利用底物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。 ? 當(dāng)接種到不含誘導(dǎo)物而含有其它可利用碳源的培養(yǎng)基中時(shí)，兩種類(lèi)型菌株同樣能較好地生長(zhǎng)，但在此環(huán)境中組成型突變株已能合成有關(guān)的水解酶，而誘導(dǎo)型菌株就不能合成。隨著恒化器培養(yǎng)中不斷加入新鮮基質(zhì)而逐漸增大組成酶變異株的優(yōu)勢(shì)，這樣就能夠比較容易地做進(jìn)一步的純化分離。在培養(yǎng)基中添加不能起誘導(dǎo)作用的低濃度底物，菌生長(zhǎng)速率極慢，而群體中少數(shù)組成型變異株則可合成有關(guān)的酶，分解利用該底物，生長(zhǎng)速率較快。 具體的篩選方法有恒化器法、循環(huán)培養(yǎng)法和誘導(dǎo)抑制物法。 一次性篩選法 噬菌體抗性菌株、耐高溫菌株 階梯性篩選法藥物抗性突變株。 ? 抗性突變菌株的篩選 抗性突變株的篩選相對(duì)比較容易，只要有 106頻率的突變體存在，就容易篩選出來(lái)。 特殊變異菌的篩選方法 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 經(jīng)誘變處理后的菌懸液在篩選前一般應(yīng)先進(jìn)行誘變后培養(yǎng)，以促使變異細(xì)胞發(fā)生分離，防止出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，篩選出不純的菌株。 菌種篩選的手段 ? 初篩 ? 從菌體形態(tài)變異分析 ? 平皿快速檢測(cè)法 具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長(zhǎng)圈法和抑制圈法等 ? 搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法也可用于初篩。初篩的手段應(yīng)盡可能快速、簡(jiǎn)單。 菌種篩選方案 ? 初篩：目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類(lèi)似的菌株盡量保留下來(lái)，使優(yōu)良菌種不致于漏網(wǎng)。 菌種篩選方法 ? 誘變處理后，突變細(xì)胞只占存活細(xì)胞的百分之幾，而能使生產(chǎn)狀況提高的細(xì)胞又只是突變細(xì)胞中的少數(shù)。 ? 如果認(rèn)為是有實(shí)用前途的代謝產(chǎn)物 ， 則要進(jìn)一步大量培養(yǎng) ， 并進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn) 、 毒性考查 、 藥物代謝等實(shí)驗(yàn) ， 并進(jìn)行提高發(fā)酵水平和改善提取工藝的工作 ， 以備投入生產(chǎn) 。 ? 鑒別可分為兩方面： 一是對(duì)微生物方面進(jìn)行形態(tài) 、 培養(yǎng) 、 生化功能答試驗(yàn)觀察 ， 并確定微生物產(chǎn)生菌的類(lèi)群； ? 二是從化學(xué)的早期鑒別來(lái)鑒別微生物的代謝產(chǎn)物 。 五、檢測(cè)系統(tǒng) ? 篩選過(guò)程的成功依賴(lài)于排除那些已知的或并非需要的代謝產(chǎn)物的檢驗(yàn)方法 ， 這樣才能識(shí)別出人們需要的化合物 。 ? 在預(yù)篩選時(shí) ， 多用瓊脂平扳擴(kuò)散抑菌法 。 ? 這種直接確定代謝產(chǎn)物用途的方法亦稱(chēng)動(dòng)物體內(nèi)治療試驗(yàn) 。 二、篩選微生物新的代謝產(chǎn)物 的程序 突變型菌株的篩選 ? 一、產(chǎn)量性狀突變株的篩選 三、篩選微生物代謝產(chǎn)物的目標(biāo) ? 篩選克服抗生素抗性菌株的活性物質(zhì)； ? 篩選抗腫瘤 、 抗病毒的活性物質(zhì)； ? 研究有藥理活性的酶抑制劑及免疫調(diào)節(jié)劑； ? 尋找食品工業(yè)最好的酵母培養(yǎng)物； ? 篩選降解有害物質(zhì)的微生物以及治療上具有低毒 、 長(zhǎng)效的化學(xué)藥物等 。 (4)通過(guò)原生質(zhì)體融合獲得新的代謝產(chǎn)物。 ? (2)對(duì)已知微生物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)修飾。 ? 4．酶處理溫度 ? 5．破壁時(shí)的 pH值 ? 6．滲透壓穩(wěn)定劑 等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨裂，而且還有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機(jī)物和 KCl和 NaCl等無(wú)機(jī)物。 3 ． 酶濃度 對(duì)于不同種屬的微生物 ， 不僅對(duì)酶的種類(lèi)要求不同 ， 就是對(duì)酶的濃度也有差異 。 如細(xì)菌加入亞抑制劑量的青霉素 。 在放線菌和細(xì)菌中 ， 制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等 。 為的是確證融合的成功 ， 可以采用多標(biāo)記菌種 。 這里最重要的是標(biāo)記必須穩(wěn)定 。 6． 生產(chǎn)性能篩選 。 4． 涂布于再生培養(yǎng)基 ， 再生出菌落 。 2． 原生質(zhì)體制備 。 (七 )有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系 。 （ 五有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株 。 (三 )遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類(lèi)似的合二為一的過(guò)程 。 一、原生質(zhì)體融合育種的特點(diǎn) (一 )雜交頻率較高：細(xì)胞壁去除后在高滲條件下形成類(lèi)似于球形的原生質(zhì)體 。 ? 原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法 。 就啤酒酵母而言 ， 運(yùn)用罕見(jiàn)交配法更易獲得結(jié)果 。 ? 酵母雜交 ? 一般而言 ， 雜交育種運(yùn)用了酵母的單雙倍生活周期 ， 將不同基因型和相對(duì)的交配型的單倍體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細(xì)胞 ， 經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀 。 兩種交配型細(xì)胞經(jīng)其細(xì)胞壁上特定的凝聚因子誘導(dǎo)而進(jìn)行交配 ， 恢復(fù)為雙倍體；同一交配型細(xì)胞之間 ， 則因細(xì)胞壁上凝集因子的存在而不能進(jìn)行交配 。 （ 二）酵母雜交育種技術(shù) ? 酵母繁殖方式 ? 酵母為單細(xì)胞型真菌 ， 一般以出芽方式生殖 ， 在通常情況下 ， 繁殖體為雙倍體 ， 但經(jīng)過(guò)特定條件的誘導(dǎo) ， 可使其產(chǎn)生單倍體孢子并可出芽產(chǎn)生單倍體繁殖體 。 ? F因子存在于細(xì)胞中形式：游離狀態(tài) (F+細(xì)胞 )；整合狀態(tài) ， 即 F因子插入胞核質(zhì)的一定位置上(Hfr細(xì)胞 )。 重組 DNA的鑒定 遺傳學(xué)方法 第七節(jié) 雜交育種 (一 )細(xì)菌雜交 ? 在細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)雜交的種類(lèi)尚不多 ， 主要是大腸桿菌 ， 其他還有鼠傷寒沙門(mén)氏菌 、 銅綠假單胞菌 、淋病奈氏球菌等 。 ? 三 、 菌落快速裂解鑒定法 ? 從平板上直接挑選菌落裂解后 ， 直接電泳檢測(cè)載體質(zhì)粒大小 ， 判斷有無(wú)插入片段存在 ， 該法適于插入片段較大的重組子初篩 。 ? 當(dāng)載體與宿主細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩個(gè)片段時(shí) ， 宿主細(xì)胞才有 β －半乳糖苷酶活性 ， 使特異的底物Xgal 變?yōu)樘m色化合物 ， 這就是所謂的 α －互補(bǔ) 。 如果重組 DNA時(shí)將外源基因插入標(biāo)志基因內(nèi) ， 該標(biāo)志基因失活 ， 通過(guò)有無(wú)抗菌素培養(yǎng)基對(duì)比培養(yǎng) ， 還可區(qū)分單純載體或重組載體 （ 含外源基因 ） 的轉(zhuǎn)化菌落 。 進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu) 、 功能 ， 或表達(dá)該基因的產(chǎn)物 。 重組克隆的篩選與鑒定 ? 基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽(yáng)性重組子的菌落 ， 并鑒定重組子的正確性 。 另一種方式是轉(zhuǎn)染 ， 即在 DNA連接酶作用下使噬菌體 DNA環(huán)化 ， 再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進(jìn)受體菌 。 二、轉(zhuǎn)染和感染 ? 利用噬菌體 DNA作為載體時(shí)可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌 。 轉(zhuǎn)化時(shí) ， 細(xì)菌必