【正文】 細胞群體的形態(tài)學特征或一些特別的生化特征應在菌種保藏前后保持同一性 ， 以及實驗室中 、 中試車間中和生產發(fā)酵中產品滴度的穩(wěn)定性 ， 后者極為重要 。 ? 對工業(yè)微生物生產菌種來說 ， 建議保藏菌種的形態(tài)學和生化特征 (如代謝產物的產生 、 酶活力 、 遺傳特征及生化指標 )應在保藏后加以檢測和確定 。 而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時 ， 抗生素的加入可幫助維持質粒復制與染色體復制的協(xié)調 。 不同菌種保藏方法比較 基因工程菌的保藏 ? 由載體質粒等攜帶的外源 DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的 、 且很易丟失其外源質粒復制子 。 ? 以液體石蠟作為保藏方法時 ， 應對需保藏的菌株預先作試驗 。 二、礦物油中浸沒保藏 ? 將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏 ， 此方法簡便有效 。 ? 但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯 、 菌體自溶 、 基因突變 。 (4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀 ， 可以將此直接振落入盛有 l～ 2ml液體培養(yǎng)基的試管中 ，輕輕振蕩 5～ l0min， 然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基 。較低的保藏溫度 (20～ 70℃ )對于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好 。 11． 干燥后 ， 在 ～ ． 12． 在所有安瓿都封蓋好后 ， 撤去真空 。 7． 維持 40℃ 的醇浴溫度 90120min， 然后調節(jié)溫控裝置 。 5． 輕輕振蕩安瓿 ， 以使細胞重新懸浮 。 2． 將冷凍槽置于歧管之下方 。 ? 大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏 10年之久而不喪失活力 。 (三 )復蘇 1． 從液氮罐中取出所需的安瓿 ， 立即置于冰浴中； 2． 迅速將安瓿置于 3740℃ 水浴中 ， 并輕輕搖動以加速解； 3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復抽吸數次，然后取 (約 8滴 )轉接入瓊脂斜面上。 所使用的甘油 — 般用高壓蒸汽滅菌 ， 而二甲亞砜最好為過濾滅菌 。 ? ? 如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含 10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。 ? 保藏過程中應注意控制保藏溫度 ， 培養(yǎng)瓶或試管應嚴格密封 。 冷凍保藏種類 一 、 普通冷凍保藏技術 (20℃ ) 二 、 超低溫冷凍保藏技術 (60一 80℃ ) 三 、 液氮冷凍保藏技術 普通冷凍保藏技術 (20℃) ? 將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細胞分接到試管或指管肉 ， 然后貯藏于一冰箱的冷藏室中 ，或于溫度范圍在 5～ 20℃ 的普通冰箱 (20℃ )中 。 一般而言 ，冷凍溫度愈低 ， 效果愈好 。 (3)菌種保藏的基本措施是低溫 、 干燥 、 真空 。 ? 將它們轉接入含誘導物的培養(yǎng)基中時，變異株能迅速利用誘導底物進行生長繁殖，而誘導型出發(fā)菌株需經歷一個誘導合成酶的階段，兩類菌株的生長就不同步，組成酶變異株所占的比例將逐漸增大。 ? 為了提高組成酶變異株的優(yōu)勢，即它在群體中的比例，可以應用恒化器培養(yǎng)技術。 ? 組成酶變異株的篩選 許多水解酶是誘導酶，只有在含有底物或底物類似物的培養(yǎng)環(huán)境中，微生物才會合成這些酶類，所以，誘導酶的生產不僅需要誘導物，而且受到誘導物的種類、數量以及分解產物的影響。營養(yǎng)缺陷型的篩選一般包括濃縮、進一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。 ? 復篩的目的是確認符合生產要求的菌株，所以，復篩步驟以質為主，應精確測定每個菌株的生產指標。 ? 為了花費最少的工作量，在最短的時間內取得最大的篩選成效，就要求采用效率較高的科學篩選方案和手段。 化學的早期鑒別一般對產生菌所產生的代謝產物進行紙上層析 、 薄板層析 、 紙上電泳 、 抗茵譜 、 高壓電泳 、 紫外分光光度法 、 液相和氣相色譜等試驗 ， 井獲得各種圖譜 ， 與已知圖譜進行比較鑒別 。 通過預篩選 ， 直接測定最初分離物的生物活性 ， 能加速篩選過程 。 四、篩選微生物代謝產物的方法 ? (一 )直接方法 ? 為了盡快確定微生物代謝產物的利用前途 ， 在體外試驗測得活性后 ， 可以將培養(yǎng)液的有效成分直接作用于機體 ， 觀察被測樣品的療效 。 ? (3)利用微生物轉化改造代謝產物的結構。 另外 ， 最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化 。 影響原生質體制備的因素 1． 菌體的前處理 為了使酶作用的效果好一些 ， 可將菌作一些前處理 。 采用抗藥性菌株除可作標記外 ， 在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾 。 5． 選擇性培養(yǎng)基上劃線生長 ， 分離驗證 ， 挑取融合子進一步試驗 、 保藏 。 二、原生質體融合育種步驟 1． 標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證 。 (四 )存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性 。 ? 原生質體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學討論會上提出來的 。 ? 酵母的雜交方法有孢子雜交法 、 群體交配法 、單倍體細胞雜交法和罕見交配法 。 ? 單倍體細胞具 α 及 ε 2兩種交配型 。 ? 大腸桿菌中存著致育因子 F， 有 F因子為 F+， 沒有F因子稱 F。 ? 而重組子由于基因插入使 α －肽基因失活 ， 不能形成 α －互補 ， 在含 Xgal的平板上 ， 含陽性重組子的細菌為無色菌落或噬菌斑 。 一、抗藥性標志的篩選 ? 如果克隆載體帶有某種抗藥性標志基因如 ampr或 tetrr ， 轉化后只有含這種抗藥基因的轉化子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落 ，這樣就可將轉化菌與非轉化菌區(qū)別開來 。 但習慣上常把以噬菌體 DNA為載體構建成的重組子導入細胞的過程統(tǒng)稱為轉染 。 ? 此外還可用電穿孔法轉化細菌 ， 它的優(yōu)點是操作簡便 、 轉化效率高 、 適用于任何菌株 。 重組 DNA導入宿主菌 ? 體外連接的重組 DNA分子必須導入適當的受體細胞中才能大量的復制 、 增殖和表達 。DNA連接是由 DNA連接酶催化完成的 。 PCR技術 ? 根據需擴增片段的兩端設計引物。 ? cDNA：用 mRNA反轉錄成單鏈 DNA，再經 DNA聚合酶的作用產生雙鏈 DNA。 其它工具酶 ? 連接酶 T4 DNA ? 修補工具酶 DNA聚合酶 I ? 末端加工酶 S1核酸酶 ， 堿性磷酸單脂酶 ? 末端轉移酶 人工加 polyA 或 polyT 尾 ? 反轉錄酶 載體－宿主系統(tǒng) ? 載體 (vector)是攜帶外源 DNA進入宿主細胞進行擴增和表達的 DNA； ? 一般是通過改造質粒 、 噬菌體或病毒等構建的 。鑒定轉化菌落。 11．在冰上放置 20min，在 37℃ 處理 2min。 6．取 10ml培養(yǎng)物置 2個冷離心管中棄去上清液。 (二 )操作步驟： 質粒 DNA轉化感受態(tài)大腸桿菌 1．從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入 10ml肉湯培養(yǎng)基中， 37℃ 培養(yǎng)過夜。 在自然條件下，許多質?？山浖毦雍匣蛳嗨品绞皆谒拗鏖g相互轉移。 每個細胞中存在的質粒數稱為該質粒的拷貝數 。 在 5～ 6個平皿上可測 20株菌以上 。 待凝固后 ， 分別在平皿的 5～ 6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營養(yǎng)物的濾紙圓片 。 這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型 。 (二 )點種法 ? 也就是任意法 。 (一 )影印法 ? 4 ． 將 CM和 MM在恒溫箱中培養(yǎng) 。 三、檢出缺陷型 ? 原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上 ， 生長情況完全不同 ， 缺陷型在 CM上生長良好 ，而在 MM上則不生長 ， 野生型都能生長 。 篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟 ? 誘變 ? 淘汰野生型 ? 檢出缺陷型 ? 確定生長譜 一、誘變方法 ? 物理誘變 ? 化學誘變 二、淘汰野生型 ? 抗生素法：野生型能在 MM中生長 ， 而缺陷型不能 ， 于是將誘變處理液在 MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長 ， 處于活化階段 ， 而缺陷型無法生長 ， 仍處于休眠狀態(tài) 。 ? 能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基 (MM)； ? 在基本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成分的稱補充培養(yǎng)基 (SM)； ? 能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基(CM)， 如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 、 麥芽汁培養(yǎng)基等 。 4．死亡率計算 將未處理的孢子液 1ml加入 1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離， 30℃ 下培養(yǎng) 3天。 MNNG的誘變作用隨 pH的升高而增強 。 7．挑取菌落進行篩選。 操作均應在紅燈下進行 ，或用黑紙包住 ， 避免白熾光 。 2． 將菌懸液放入一巳滅菌的 ， 裝有玻璃珠的三角瓶內用手搖動 ， 以打散菌體 。 ? 被照射的菌懸液細胞數，細菌為 106個／ ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為 106～ 107個／ ml。在數量減少后就要仔細比較參加復篩和再復篩的菌株 ， 最后才能選得優(yōu)秀菌株 。 (五 )分離和篩選 ? 篩選分初篩和復篩 。 (四 )中間培養(yǎng) 由于在發(fā)生了突變尚未表現出來之前 ， 有一個表現延遲的過程 ， 即細胞內原有酶量的稀釋過程 (生理延遲 )， 需 3代以上的繁殖才能將突變性狀表現出來 。 6．根據采用的誘變劑或根據細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復處理會使細胞產生抗性，使誘變效果下降。 2． 在生產中經生產選種得到的菌株與野生型較相像 ， 也是良好的出發(fā)菌株 。 4． 紫外線仍十分有效 。 誘變劑的選擇 1． 堿基類似物和羥胺具有很高的特異性 ， 但很少使用 ， 回復突變率高 ， 效果不大 。 化學誘變劑是很經濟的 ， 因為只需要少量的合適的誘變劑 ， 設備是實驗室的一般玻璃器皿 ，一個蒸氣罩 。 ? 其他的幾種射線都是電離性質的 ， 有一定的穿透力 ， 一般都由專業(yè)人員在專門的設備中使用 ，否則有一定危險性 。 第四節(jié) 誘變育種 ? 以微生物的自然變異作為基礎的生產選種的機率并不很高 ， 一個基因的自然突變頻率僅 1061010左右 。 ? (2)誘導解除基因表達抑制的突變 。 (5)改進菌種外泌產品的能力 。 工業(yè)菌種改良方法 (1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數或增加相應基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟 ， 由此提供一個旁路代謝途徑 。 ? (2)希望基因型的選出 。 進行類似新種篩選分離 ， 達到獲得新的優(yōu)良生產菌種的目的 。 ? 水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離 。 選擇性抑制培養(yǎng)基可使非目標微生物消除或減少到一定程度。 改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的分離 。 ? 成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不同的生長形態(tài) 、 從而初步地加以鑒定 ，在分離放線菌時顯得尤為重要 。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。 ? 選擇性地添加抗生素 。 (二 )生態(tài)學參數 ? 放線菌分離培養(yǎng)過程中所需考慮的生態(tài)參數有溫度 、 pH、 離子強度 、 氧化還原電勢和底物濃度 。 將認為有希望的菌落用牙簽轉接到另一模擬分離瓊脂平板上進行篩選 。 ? 通過改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細菌 、 中溫菌和嗜高溫菌 。用樣本稀釋液適度稀釋 ,涂布平板倒置培養(yǎng)或濾紙壓印分離法。 ? 富集可以促進抗性的產生并維持下來。 培養(yǎng)基的生物物理學參數，如 pH及鹽分也應調節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數值相近。 就分離培養(yǎng)基的組成而言 ， 部分培養(yǎng)基中必須含有 1050%的天然提取物 。 采集瓶從水中取出時應迅速并帶有較大的弧度 。 3．水樣采集方法 ? 用于細菌檢測的水樣應收