【正文】 性內(nèi)切酶的剪切方式 宿主細胞必須符合以下條件 ? 對載體的復(fù)制和擴增沒有嚴格的限制； ? 不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源 DNA； ? 在重組 DNA增殖過程中，不會對它進行修飾； ? 重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組； ? 容易導(dǎo)入重組 DNA分子； ? 符合重組 DNA操作的安全標準。 質(zhì)粒 DNA分子常呈現(xiàn) 三種 形態(tài)；常見的一種是共價 、閉環(huán)狀 DNA(CCC DNA)；其次是由于一條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán) DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性 DNA。 每個細胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù) 。 ? 重組體 種類 較多； ? 遺傳物質(zhì)的 傳遞更完整； ? 采用溫度、藥物或紫外線照射燈處理鈍化一方的親株原生質(zhì)體，再融合，可以 提高篩選頻率 ； ? 可以把 原生質(zhì)體融合與其他育種方法結(jié)合 起來，提高篩選效率。 ? 原生質(zhì)體融合受接合型或致育型的限制較小，因此 有利于不同種屬間微生物的雜交。 ? 融合子的選擇 ：在選擇培養(yǎng)基上，通過兩個親本的遺傳標記互補而選擇融合。 ? 原生質(zhì)體的制備 ：用相應(yīng)的酶脫去菌體的細胞壁，制得完整的原生質(zhì)體。 ?可以用選擇性培養(yǎng)基篩選分離子，也可以將雜合雙倍體單孢子分離于完全培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至菌落成熟，檢查大量雙倍體菌落，在一些菌落上有突變顏色（隱性標記）的斑點或扇面出現(xiàn)，從每個菌落接出一個斑點或扇面的孢子于完全培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)后經(jīng)過純化和鑒別即得分離子。 或者將大量異核體孢子分離于基本培養(yǎng)基平板上從中長出野生型原養(yǎng)性菌落，將其挑出分離純化，即得雜合雙倍體。 ?在基本培養(yǎng)基上 ,強迫兩株營養(yǎng)缺陷型互補營養(yǎng)，則這兩個菌株經(jīng)過菌絲細胞間的吻合形成異核體。作為直接親本的遺傳標記有多種，如營養(yǎng)突變型、抗藥突變型、形態(tài)突變型等。 用來進行雜交的兩個野生型菌株叫 原始親本 。 霉菌的雜交育種 ? 霉菌的雜交育種主要是通過體細胞的核融合和基因重組，即通過準性生殖過程而不是通過性細胞的融合。 ?現(xiàn)在常用的放線菌雜交方法主要有三種： 混合培養(yǎng)法、平板雜交法和玻璃紙轉(zhuǎn)移法 。 在鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌、肺炎克氏桿菌、霍亂弧菌等許多細菌中也發(fā)現(xiàn)了接合現(xiàn)象，但是 至今未在革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)接合現(xiàn)象 。 ?這兩個菌株各自都不能在基本培養(yǎng)基上生長，如果把大約 105 /ml濃度的上述兩種菌株混合在一起，并接種在 基本培養(yǎng)基 上，則能長出少數(shù)菌落；如果把上述兩種菌株分別接種到一個特制的 U型管的兩端去培養(yǎng) ,中間用一片可以使培養(yǎng)液流通 ,但不能使細菌通過的燒結(jié)玻璃隔開 ,那么在基本培養(yǎng)基上就不會出現(xiàn)菌落。 細菌的雜交 ? 細菌的雜交行為是于 1946年首次在大腸桿菌 K12菌株中發(fā)現(xiàn)并證實的。 三、 雜交育種 兩個不同基因型的菌株通過結(jié)合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離和篩選出具有新性狀的菌株。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約 ～ ，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。 一般我們常以細胞的死亡率表示 ， 希望照射的劑量死亡率控制在 70～ 80%為宜 。 出發(fā)菌株選擇應(yīng)考慮的問題 ? 出發(fā)菌株的穩(wěn)定性 ? 選用具備優(yōu)良特性的菌株 ? 挑選對誘變劑敏感的菌株 ? 注意菌株的生理狀態(tài)及生長發(fā)育時間 出發(fā)菌株 ? 野生菌株 ? 自發(fā)突變后獲得的高產(chǎn)菌株 ? 已經(jīng)誘變過的菌株 ? 考慮試驗菌株的遺傳背景：各種誘變劑有不同的作用機制，一種誘變劑的作用常主要集中在DNA的某些特異部位上，多次反復(fù)用一種誘變因子易出現(xiàn) “飽和”或恢復(fù)突變現(xiàn)象，因此誘變時常采用多種不同的誘變因子或復(fù)合誘變因子。 ? 營養(yǎng)缺陷型突變株 ： 由于代謝障礙而成為必須添加某種物質(zhì)才能生長的突變株。 ? 致死突變型 ： 生活力下降的突變型。 原種（出發(fā)菌株） ?純化 ?斜面培養(yǎng) ?完全培養(yǎng)基同步培養(yǎng) ?離心洗滌 ?玻璃珠震蕩分散 ?過濾?單細胞或孢子懸浮液 ? 活菌計數(shù) 誘變處理 ? 誘變處理預(yù)備實驗 ? 處理液活菌計數(shù) 平板分離 ? 形態(tài)變異并計算其變異率 斜面培養(yǎng) ?初篩、復(fù)篩 ?自然分離和再復(fù)篩 保藏及擴大試驗 誘 變 育 種 ? 出發(fā)菌株的選擇 ? 誘變劑的選擇 ? 誘變操作（包括誘變劑量的選擇） ? 突變株的篩選 ? 突變高產(chǎn)菌的表現(xiàn)及篩選條件的配合 形態(tài)突變 高產(chǎn)突變 耐藥性突變 營養(yǎng)缺陷型突變 結(jié)構(gòu)類似物抗性突變 ? 形態(tài)突變型 ： 指發(fā)生細胞形態(tài)變化或菌落形態(tài)變化的突變型。 誘變劑 物理：紫外線 ， 快中子 化學(xué)：硫酸二乙酯 ， 亞硝基胍 生物：噬菌體 誘變育種的主要環(huán)節(jié) （ 1）以 合適的誘變劑 處理細胞懸浮液 —— 誘變 （ 2）用 合適的方法 淘汰負效應(yīng)變異株， 選出性能優(yōu)良的正變異株 —— 篩選 按照生產(chǎn)的要求，根據(jù)生物的遺傳和變異的理論，用人工的方法造成菌種變異，再經(jīng)過篩選、而達到菌種誘變選育的目的 。 生產(chǎn)性能的測定 一般采用兩步法： 初篩：以量為主 復(fù)篩：以質(zhì)為主 二、誘變育種 用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變。 從最后稀釋菌液中吸取 ，置入準備好的無菌瓊脂內(nèi)。 將試管于震蕩機上，使菌液混合均勻 取出試管中的第一次十倍稀釋菌液 1mL， 加入另一個新的含 9mL無菌水的試管中。 步驟十 需要使用的儀器 —— 震蕩機 固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法 吸取準備好欲稀釋的菌液 吸取充分均勻后的菌液 取含有 9mL無菌水之試管，將試管口過火滅菌。完成后的營養(yǎng)平板，如右上圖。 步驟七 重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。 步驟五 重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。 步驟三 更換一個新的無菌營養(yǎng)平板 步驟四 將接種針上的細菌劃于一個新的營養(yǎng)平板上。 ?稀釋法：菌落單一均勻。 ?采土方式： 在選好適當(dāng)?shù)攸c后 ， 用小鏟子除去表土 ， 取離地面 515cm處的土約 10g， 盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中 ， 扎好 ， 標記 ， 記錄采樣時間 、 地點 、 環(huán)境條件等 ， 以備查考 。 采樣的對象也可以是植物 ， 腐敗物品 ， 某些水域等 。 第三節(jié)、菌種的選育 一、自然選育 采樣 采樣對象 以 采集土壤 為主 。 生長因子產(chǎn)生菌的篩選： 通過觀察分離菌能否促進 營養(yǎng)缺陷型（ auxotroph） 的生長，便可檢出生長因子產(chǎn)生菌。 藥理活性化合物生產(chǎn)菌的篩選 ： 一種化合物如果能在體外抑制某種關(guān)鍵的人體酶，它就可能在體內(nèi)具有藥理作用。 抗生素生產(chǎn)菌的篩選 ： 把潛在的產(chǎn)生菌生長在含有試驗菌的平板上，可以鑒定產(chǎn)生菌的抗微生物作用。 堿性蛋白酶的產(chǎn)生菌能消化平板的不溶性蛋白，產(chǎn)生一清晰圈。 . 堿性蛋白酶的分離 用不同 p