【正文】 產(chǎn)物形成時間推遲 種齡過長 菌種趨于老化，菌體自溶早 生產(chǎn)能力下降 52 ? 不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡 有很大差異 ，一般需經(jīng)過多種實驗來確定。菌體的 生理活性因不同的生長階段而差別很大，種齡的控制就顯得非常重要。 ? 泡沫 影響正常的通氣攪拌，應(yīng)控制培養(yǎng)基的滅菌質(zhì)量，甚至考慮改變培養(yǎng)基配方，以減少發(fā)泡。 ? 青霉素生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差 1倍。 48 ? 谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基成分表 用途 成分（ %） 規(guī)模 保藏 牛肉膏 1，蛋白胨 1，瓊脂粉 ， 無機(jī)鹽 斜面 添加 ，其余同上 一級 口服葡萄糖 3，玉米漿 ，尿素 ， 1200 ml /5000 ml 二級 玉米淀粉雙酶糖 ， 玉米漿 ，甘蔗糖蜜 ，尿素 ，無機(jī)鹽等 / 2 m3 三級 玉米淀粉雙酶糖 ， 玉米漿 ，甘蔗糖蜜 液氨，復(fù)合維生素 mg/L， 無機(jī)鹽等 12 / 20 m3 發(fā)酵 玉米淀粉雙酶糖 1314，玉米漿 ，甘蔗糖蜜 ，液氨，維生素 50 g，無機(jī)鹽等 154 / 240 m3 49 培養(yǎng)條件 ? 種子培養(yǎng)應(yīng)選擇最適溫度，該溫度與發(fā)酵最適溫度可能不一致。 ? 孢子質(zhì)量、 ? 培養(yǎng)基、 ? 培養(yǎng)條件、 ? 種齡 ? 接種量 47 培養(yǎng)基： ? 選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的營養(yǎng)成分，使菌絲粗壯并具有較強的活力； ? 要易于被菌體直接吸收和利用，如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等 ； ? 營養(yǎng)成分要 比發(fā)酵培養(yǎng)基 適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高； ? 組分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近 ， 這樣種子移入發(fā)酵罐后能比較容易適應(yīng)發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件 (馴化 )。 ? 無雜菌 污染 。 ? 產(chǎn)物生成量： 在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因為種子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。 Ⅵ 期即菌絲自溶期，菌體開始自溶。 Ⅳ ~Ⅴ 期稱青霉素分泌期，此時菌絲生長趨勢漸減弱。產(chǎn)生青霉素較少，而菌絲濃度增加很多。 ? Ⅵ 期：細(xì)胞內(nèi)看不到顆粒，并出現(xiàn)個別自溶的細(xì)胞。 ? Ⅴ 期 形成大空孢子其中含有一個或數(shù)個染色的大顆粒。 ? Ⅳ 期 脂肪粒減少，形成中、小空孢子。 ? Ⅲ 期：形成脂肪粒，積累貯藏物。孢子先膨脹再形成小的芽管，此時原生質(zhì)未分化，具有小空孢。 ? 菌體生長階段（種齡）：處于對數(shù)生長期后期， 菌體量未達(dá)到高峰。生產(chǎn)上 常用的種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)： (1) 細(xì)胞或菌體： 看顏色、聞氣味；顯微鏡下觀察菌體形態(tài)；測 定 菌體濃度和粘度等。 41 ? 種子的質(zhì)量是發(fā)酵能否正常進(jìn)行的重要因素之一。但也與所選用工藝條件有關(guān)。 ? 產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌，產(chǎn)孢子能力弱、孢子發(fā)芽慢，先將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖床上培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為 種子罐 種子。 39 ? 谷氨酸生產(chǎn)中，采用茄瓶斜面或搖瓶種子接入種子罐于 32℃ 培養(yǎng) 7~10h，菌體濃度達(dá) 108~109個 /mL，即可接入發(fā)酵罐作為種子。 38 ? 種子罐的級數(shù)確定主要決定于 ① 種子的傳代穩(wěn)定性； ② 孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度； ③ 孢子瓶中孢子的密度； ④ 發(fā)酵罐的容積和 接種量的要求。 ? 二級發(fā)酵： 一級種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵稱為二級發(fā)酵。 ? 一級發(fā)酵： 采用直接將孢子或菌絲體接入罐中發(fā)酵，稱為一級發(fā)酵。 ? 一級種子： 把孢子瓶中的孢子或搖瓶菌絲接入到種子罐中，孢子發(fā)芽并繁殖成的大量菌體 (絲 )。 優(yōu)點： 對于生長、發(fā)芽緩慢的菌種，可以縮短種 子在種子罐內(nèi)的培養(yǎng)時間， 缺點： ① 現(xiàn)制現(xiàn)用，菌絲不易保存； ② 批與批之間差異，易造成生產(chǎn)波動； ③ 孢子制備工藝拖長，增加染菌機(jī)會。也易于保存； ③ 操作簡便、不易污染雜菌。 ? (2) 種子進(jìn)入種子罐方式 ： ?孢子進(jìn)罐法 ?搖瓶菌絲進(jìn)罐法 36 ? 孢子進(jìn)罐法： 是將固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的孢子制成孢 子懸浮液直接接入種子罐的方法。 ? 種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，在工廠歸發(fā)酵車間管理，因此稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。原則上各種營養(yǎng)成分不宜過濃，子瓶培養(yǎng)基濃度比母瓶略高，更接近于種子罐的培養(yǎng)基配方。 ? 搖瓶培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件與種子罐相似。 ? 種子罐培養(yǎng)一方面獲得足夠數(shù)量的菌種，另一方面種子罐中的培養(yǎng)基更接近發(fā)酵培養(yǎng)液成分和培養(yǎng)條件，如通無菌空氣，攪拌形式等，以使菌體適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，起馴化作用。 32 第二節(jié) 種子制備過程與質(zhì)量控制 33 一、種子制備過程 ? 廣義的種子制備 包括 孢子制備 和 菌絲制備 ，狹義的種子制備單指： ? 將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的孢子或菌體轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其繁殖成大量菌絲或菌體的過程。 31 ? 三、孢子質(zhì)量的 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和 檢查 ? 斜面孢子 /米孢子質(zhì)量檢查 ? (1) 外觀檢查； ? (2) 無菌檢查； ? (3) 搖瓶生產(chǎn)能力檢查 。 ? 接入種子罐的孢子接種量 對發(fā)酵生產(chǎn)也有影響。 30 （四）接種量 ? 斜面接種量： 接種量的大小影響到在一定量培養(yǎng)基中孢子的 個體數(shù)量 的多少，進(jìn)而影響到菌體的生理狀況，接種量過大或過小均對孢子質(zhì)量產(chǎn)生影響 。 ? 鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在 6? C冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低 18%，冷藏 3個月后降低 35%。而培養(yǎng)5天以后冷藏， 20天未發(fā)現(xiàn)自溶。 29 ? 孢子的冷藏時間 ? 斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。 ? 措施： 孢子培養(yǎng)的時間應(yīng)該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。 28 （三）培養(yǎng)時間和冷藏時間 孢子的培養(yǎng)時間 ? 孢子的培養(yǎng)時間對孢子質(zhì)量有重要影響，一般來說： ? 過于年輕的孢子經(jīng)不起冷藏， ? 衰老的孢子會導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。 ? 一般來說，真菌對濕度要求偏高，放線菌對濕度要求偏低。 相對濕度 (%) 斜面外觀 活孢子計數(shù)（億 /支） ~19 25~36 40~45 上部稀薄、下部稠略黃 上部薄、中部均勻發(fā)白 一片白，孢子豐富，稍皺 27 ? 在 南方 氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢，主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。 龜裂鏈霉菌孢子制備時發(fā)現(xiàn)：北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。因此，培養(yǎng)溫度不同，菌的生理狀態(tài)也不同， 如果不是用最適溫度培養(yǎng)的孢子，其生產(chǎn)能力就會下降。因此，龜菌斜面先在℃ 培養(yǎng) 3天，再在 ℃ 培養(yǎng) 1天，所得的孢子數(shù)量比在 ℃ 培養(yǎng) 4天所得的孢子數(shù)量增加 3～ 7倍。要獲得高質(zhì)量的孢子，最適溫度區(qū)間很狹窄，一般各生產(chǎn)單位都嚴(yán)格控制孢子和斜面的培養(yǎng)溫度。 ? 作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源， 目的是便于選擇特殊代謝的菌落 。 ? 菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。 ? 瓊脂的牌號不同，對孢子質(zhì)量也有影響，這是由于不同牌號的瓊脂含有不同的無機(jī)離子造成的。 23 ? 原材料中無機(jī)離子、微量元素如 Mg2+ 、 Cu2+ 、 Ba2+能刺激孢子的形成。 ? 例如