【正文】 蛋白質(zhì)凝固，提高濾液(也稱為原液)質(zhì)量。1，高價無機離子的去除方法（1）鈣離子，可用草酸。去除會影響后續(xù)提取的高價無機離子。 3，選擇下游加工工藝的原則：（1）是胞內(nèi)產(chǎn)物還是胞外產(chǎn)物 （2）原料中產(chǎn)物和主要雜質(zhì)濃度 （3）產(chǎn)物和主要雜質(zhì)的物理化學(xué)特性及差異 （4）產(chǎn)品用途和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) （5）產(chǎn)品的市場價格 （6）廢液的處理方法等 第二節(jié) 發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離發(fā)酵液預(yù)處理和固液分離的目的：分離菌體和其他懸浮顆粒(細胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物)；除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液性質(zhì)，以利于提取和精制的順利進行。（3）高度純化 ：去除與產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)比較接近的雜質(zhì)。2，工藝過程的劃分：發(fā)酵的下游加工過程可以下過程：（1）預(yù)處理和固液分離 ：目的是除去發(fā)酵液中的菌體細胞和不溶性固體雜質(zhì)。由于生物產(chǎn)品品種多，性質(zhì)各異，故用到的單元操作很多，其中如蒸餾、萃取、結(jié)晶、吸附、蒸發(fā)和干燥等屬傳統(tǒng)的單元操作，理論比較成熟，而另一些則為新近發(fā)展起來的單元操作，如細胞破碎、膜過程和色層分離等，缺乏完整的理論，介于兩者之間的有離子交換過程等。三、分離過程的機理與分離操作1，物理性質(zhì)（1）力學(xué)性質(zhì)：重力、離心力、篩分；（2）熱力學(xué)性質(zhì)：狀態(tài)變化、相平衡；（3）傳質(zhì)性質(zhì)：粘度、擴散、熱擴散；（4）電磁性質(zhì)：電泳、電滲析、磁化；2，化學(xué)性質(zhì)（1）化學(xué)熱力學(xué)；化學(xué)平衡；（2）反應(yīng)動力學(xué)：反應(yīng)速率；（3）光化學(xué)性質(zhì)：激光激發(fā)、離子化；3，生物學(xué)性質(zhì)（1）分子識別：生物親和作用、生物學(xué)識別；（2）輸送性質(zhì)：生物膜輸送；（3）反應(yīng)、響應(yīng)、控制：酶反應(yīng)、免疫系統(tǒng)。另一個特點是欲提取的生物物質(zhì)通常很不穩(wěn)定、遇熱、極端pH、有機溶劑會引起失活或分解。分散在其中的固體和膠狀物質(zhì)，具可壓縮性，其密度又和液體相近，加上粘度很大，屬非牛頓性液體，使從培養(yǎng)液中分離固體很困難。對重組DNA發(fā)酵、精制蛋白質(zhì)的費用可占整個生產(chǎn)費用的80%~90%。它由一些化學(xué)工程的單幾操作組成，但由于生物物質(zhì)的特性，有其特殊要求，而且其中某些單元操作一般化學(xué)工業(yè)中應(yīng)用較少。 第十二章 產(chǎn)物的提取與精制第一節(jié) 概論一、下游加工過程在發(fā)酵工程中的地位1，下游加工過程的定義 發(fā)酵產(chǎn)品系通過微生物發(fā)酵過程、酶反應(yīng)過程或動植物細胞大量培養(yǎng)獲得。如谷氨酸發(fā)酵在初期感染噬茵體，可以利用噬菌體只能在生長階段的細胞(即幼齡細胞)中繁殖的特點，將發(fā)酵正常并已培養(yǎng)了16~18小時(此時菌體己生長好并肯定不染菌)的發(fā)酵液加入感染噬菌體的發(fā)酵液中，以等體積混合后再分開發(fā)酵。4)將培養(yǎng)液重新滅菌再接種(噬菌體不耐熱，70~80℃經(jīng)5分鐘即可殺死)。2)輪換使用專一性不同的菌株。車間四周要經(jīng)常進行檢查，如發(fā)現(xiàn)噬菌體即時用藥液噴灑。為了不讓活的生產(chǎn)菌逃出，發(fā)酵罐的排氣管要用汽封或引入藥液(如高錳酸鉀、漂白粉或石灰水等溶液)槽中，取樣、洗罐或倒罐的帶菌液體要處理后才允許排入下水道。因為噬菌體是專一性的活菌寄生體，不能脫離寄主自行生長繁殖，如果不讓活的生產(chǎn)菌在環(huán)境中生長蔓延也就堵塞了噬茵體的滋生場地和繁殖條件。設(shè)備的滲漏、空氣系統(tǒng)、培養(yǎng)基滅菌不徹底都可能是噬菌體感染的途徑。第五節(jié) 噬菌體感染和處理方法利用細菌或放線菌進行的發(fā)酵容易感染噬菌體。(3)對染菌的種子罐可在罐內(nèi)放水后進行滅菌，滅菌后水量占罐體的三分之二以上。 (2)對染菌的罐，在培養(yǎng)液滅菌前先加甲醛進行空消處理。還有將種子罐中種子培養(yǎng)好后，進行冷凍保壓(，10℃左右)，經(jīng)平板檢查證明無雜菌后，再接入發(fā)酵罐發(fā)酵，這一措施在一些谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工廠取得很好效果。 因而不是所有發(fā)酵都能使用抑菌劑。 在染菌的發(fā)酵液內(nèi)添加抑菌劑(如小劑量的抗菌素或醛類)用以抑制雜菌的生長也是一種辦法。中后期染菌，如果雜菌的生長將影響發(fā)酵的正常進行或影響產(chǎn)物的提取時，應(yīng)該提早放罐。 如果種子培養(yǎng)或種子罐中發(fā)現(xiàn)污染，則這批種子就不能再繼續(xù)擴大培養(yǎng)，因為此時的損失畢竟是很小的。對于發(fā)酵周期短的菌株、突變影響小的發(fā)酵，采用保壓不進行空罐滅菌的辦法是可行的，但經(jīng)一定發(fā)酵批數(shù)后仍需定期進行空罐滅菌，否則較難避免雜茵污染與遺傳突變的影響。 大型發(fā)酵罐大多采用連續(xù)滅菌，這時空罐需先行滅菌。有些工廠為了節(jié)約蒸汽，直接進行實罐滅菌而不進行空罐滅菌，他們只有在檢修后或在節(jié)日停工后以及春夏季節(jié)發(fā)酵罐空置了24小時以上時才進行空罐滅菌。3，其他操作問題實罐滅菌時，當(dāng)經(jīng)過加熱和維持時間后開始冷卻，此時可能因蒸汽冷凝而使罐壓突然降低甚至?xí)纬烧婵?，所以此時必須將無菌空氣通入罐內(nèi)保持一定壓力，并注意壓力變化，隨時進行調(diào)節(jié)。所以在發(fā)生泡沫時應(yīng)加以清除(加消泡劑和在操作上予以控制)。泡沫嚴(yán)重時會上升到罐頂甚至逃液，此時操作就比較困難?？傊?，滅菌時蒸汽壓力要求平穩(wěn)，在壓力變動較大時，操作人員需靈活掌握加以控制。 為了加快加熱時間，凡能進蒸汽的管路在滅菌時都可同時進汽，但各管路的阻力不同，大量蒸汽從阻力小的進汽管中沖入罐內(nèi)，這是一種蒸汽短路現(xiàn)象，使物料受熱不勻，部分培養(yǎng)液過熱而部分培養(yǎng)液則可能滅菌不透，尤其是罐底的空氣分布管是主要的進汽口，但由于液柱壓力較大，阻力就比其他進口大，所以在滅菌操作時應(yīng)將空氣分布管的進口閥門開得比其他進氣口的閥門大一些，以保證有足夠的蒸汽從空氣分布管進入，促使培養(yǎng)液激烈翻動起攪拌混和作用。根據(jù)操作經(jīng)驗，能否達到徹底滅菌的目的在于罐內(nèi)壓力能否控制得與應(yīng)該達到的溫度相對應(yīng)，例如罐壓已達到1公斤/厘米2而料溫卻并未達到120℃，則某些耐熱的細菌芽孢就難以完全殺死。進年大部分通風(fēng)發(fā)酵工程均采用膜過濾器取代傳統(tǒng)的棉花過濾器，上述問題已得到很好的解決。 超細玻璃纖維紙的周圍密封要可靠，空氣閥和蒸汽閥要緩開緩閉，避免因流速突然升高將過濾紙擊穿。如為冷凝水將使介質(zhì)受潮，如為發(fā)酵液則過濾介質(zhì)被浸透結(jié)成硬塊使過濾器失效。 過濾器滅菌用的蒸汽閥的微小滲漏會使蒸汽管路中的冷凝水抽吸到過濾器內(nèi)使過濾介質(zhì)受潮，影響過濾效果，所以最好裝設(shè)雙重閥以防滲漏。 大多數(shù)產(chǎn)品在整個發(fā)酵期間需要改變空氣流量，但油水分離設(shè)備、過濾器的過濾面積和長度是根據(jù)空氣流速來設(shè)計的，空氣流速的改變就會影響油水分離效果和過濾效率，所以設(shè)計時要充分注意這種情況，掌握空氣流量改變的范圍，選擇合適的空氣流速。要根據(jù)發(fā)酵的特點和要求選用合理的空氣流程并選用高效的氣液分離設(shè)備(如氣液過濾網(wǎng))。排出蒸汽均勻并呈青色有力表示情況良好，排出蒸汽呈霧狀無力表明壓得太緊，而當(dāng)排出蒸汽斷續(xù)不均勻以及進出口兩測的壓力降過小時則就有可能是過濾層有位移現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)不正常的情況應(yīng)立即予以糾正。之后，灰化的活性炭隨氣流逸出，整個過濾介質(zhì)的體積減小使過濾層傾斜甚至發(fā)生翻身的現(xiàn)象，致使大量未經(jīng)過濾的空氣進入發(fā)酵罐內(nèi)造成嚴(yán)重的染菌事故。 過濾器器壁腐蝕形成氧化鐵層，氧化鐵是一種多孔物質(zhì)，空氣會在其中穿過而得不到過濾，因而也會使空氣中帶茵并造成污染。對于棉花過濾器最合適的充填密度是160~180公斤／米3；玻璃纖維是130~180公斤／米3左右。同時，在過濾介質(zhì)用蒸汽滅菌時，太緊則蒸汽穿透力差，穿透力差滅菌效果也差。走短路的那部分空氣沒有經(jīng)過充分過濾而帶菌，進入發(fā)酵罐將使發(fā)酵染菌。所以排氣管要與罐的尺寸有一定比例，不宜過大或過小。另外排氣管的直徑太大，滅菌時蒸汽流速小也會使管中部分耐熱菌不能全部殺死。如圖713a所示有一小段管路存在蒸汽不流通的死角，所以應(yīng)在閥2的半截上裝設(shè)旁通，焊上一個小的放氣閥，如圖713b所示，此段管路即可得到蒸汽的充分滅菌。利用注射器在罐的接種口橡皮膜上注入罐內(nèi)進行接種，在操作時要注意防止注射器針孔堵塞。存種子的血清瓶上裝有橡皮管，在火封下與罐的接種口相連接，利用兩者的壓力差使種子進入罐內(nèi)，要求瓶與橡皮管的連接不漏，橡皮管與接種口的大小一致。 采用復(fù)合鋼板(將兩種不同材質(zhì)的鋼板軋合為一體的鋼板)制造發(fā)酵罐，因為兩層鋼板緊密結(jié)合在一起，中間沒有空隙，所以不會產(chǎn)生上述問題，是一種理想的材料。發(fā)生這種事故后，如襯里鋼板尚未破裂可用罐內(nèi)加水壓的方法將其恢復(fù)原狀(水的壓力不應(yīng)超過設(shè)備的允許使用壓力)，應(yīng)盡可能避免錘擊，用錘擊的方法使鋼板受力不勻易造成破損。所以對于不銹鋼襯里設(shè)備加工時應(yīng)該盡可能增加襯里的剛度，其辦法是每隔一定距離用點焊增加襯里與鋼制殼體的連接強度，減少鼓起的可能性。如果不銹鋼襯里加工焊接不善，在鋼板和焊縫處有裂縫，或在操作時不注意，使不銹鋼皮鼓起后產(chǎn)生裂縫，發(fā)酵液就會通過裂縫進入襯里和鋼板之間，窩藏在里面形成死角(圖7~12)。3，不銹鋼襯里的死角 某些有機酸的發(fā)酵對碳素鋼有腐蝕時，小型發(fā)酵罐通常采用不銹鋼制造。 發(fā)酵罐中除了上述容易造成死角的地區(qū)外，其他還有一些容易造成死角的地區(qū)，如擋板(或冷卻列管)與罐身固定的支撐板周圍和不能在滅菌時排氣的百腸管，溫度計接頭等，對于這些地區(qū)每次放罐后的清洗工作應(yīng)注意，經(jīng)常檢查。如果在底軸承下增設(shè)一個小型攪拌槳就可以適當(dāng)改善罐底積垢的情況(圖710)。對這種情況的發(fā)酵罐必須定期鏟除罐底積垢。2，渣滓在罐底與用環(huán)式空氣分布管所形成的死角 培養(yǎng)基中如果含有鈣鹽類及固形物，在發(fā)酵罐的攪拌功率較小和采用環(huán)式空氣分布管的情況下，由于在滅菌時培養(yǎng)基得不到強有力的翻動，罐底會形成一層1—2毫米甚至更厚的膜層(圖79)。例如法蘭與管子焊接時受熱不勻使法蘭翹曲密封面發(fā)生凹凸不平現(xiàn)象就會造成死角(圖78c)。現(xiàn)將經(jīng)常出現(xiàn)死角的場合及形成死角的幾種原因介紹如下：1，法蘭連接的死角如果對染菌的概念了解不夠，按照一般化工廠管路的常規(guī)加工方法來焊接和安裝管道法蘭就會造成死角。（四）發(fā)酵罐與管件的死角所謂死角是指滅菌時因某些原因使滅菌溫度達不到或不易達到的局部地區(qū)。在滅菌操作時，將旁路閥門打開，使蒸汽自由通過。如有自控和測量儀表，那末還應(yīng)包括這些儀表所需的有關(guān)管路(圖中末包括)。倘若使用一根總的排氣管時，必須選擇較大直徑的管子，保證排氣下水通暢不致倒回到發(fā)酵罐內(nèi)。排氣管路的串通連接尤其不利于污染的防止。（三）管路的配置 1，排氣管與下水管發(fā)酵廠中若干發(fā)酵罐的排氣管路大多匯集在一條總的管路上，以節(jié)約管材，下水管亦然。但需經(jīng)常拆卸的管路則不宜用焊接連接。 （3）焊接焊接的方法比其他方法簡便，而且密封可靠。所以，重要的管路連接大多采用法蘭連接。由于管路受冷熱和震動的影響，活接頭的接口易松動，使密封面不能嚴(yán)密而造成滲漏。(1)螺紋連接螺紋連接需在管端鉸出管螺紋，安裝時在螺紋上涂以白漆并加麻絲(也有用聚四氟乙烯薄膜)作為填料，如密封要求高的可用石墨粉加少許機油作為填料，或用氧化鉛甘油膠合劑更好。但須定期檢查隔膜有否老化及脫落。3)閥結(jié)構(gòu)為流線型，流量大，阻力小，無死角，無堆積物，在關(guān)閉時不會使緊密面軋壞。隔膜閥有以下優(yōu)點： 1)嚴(yán)密不漏。閥體內(nèi)裝有橡皮隔膜，用螺釘與閥芯連接，當(dāng)閥桿作上下運動時就帶動隔膜上升或下降。閥門在使用一定時間后，閥桿磨損或填料損壞也會引起滲漏，就需要將填料壓蓋適當(dāng)擰緊或更換填料。②填料的滲漏。截止閥在使用中經(jīng)常發(fā)生以下兩個問題： ①閥心軋壞。平面形緊密面的墊料采用橡膠或聚四氟乙烯，關(guān)閉后墊料與閥座緊緊地吻合，達到不漏的目的。 （1）截止閥(圖76) 閥體為橫放的S形，閥座與閥心的接觸面小，污物不易附在上面，但構(gòu)造比較復(fù)雜，流體阻力較大。與發(fā)酵罐直接連通的管道更應(yīng)選用密封性較高的閥門。所以，與發(fā)酵有關(guān)的管路不能同一般化工廠的化工管路完全一樣，而有其特殊的要求。 （二）管件的滲漏 與發(fā)酵罐相連接的管路很多，有空氣、蒸汽、水、物料、排氣、排污等管路，管路多，相應(yīng)的管件和閥門也多。有夾套的發(fā)酵罐可在夾套內(nèi)用水壓或氣壓的試驗方法檢查罐壁有無滲漏。 2，罐體的穿孔 浸沒在液體中的罐體部分都有可能發(fā)生腐蝕穿孔，特別是罐底，由于管口向下的空氣管噴出的壓縮空氣的沖擊力以及發(fā)酵液中的固體物料在被攪動時對罐底發(fā)生摩擦，罐底極易磨損引起滲漏，這種磨損形式是鋼板產(chǎn)生麻點般的斑痕，稱為麻蝕。采用不銹鋼制造的冷卻管，耐腐蝕情況比普通鋼管要好得多，產(chǎn)生漏孔的機會也比普通鋼管少。氣壓法是先在發(fā)酵罐內(nèi)放滿清水，用壓縮空氣通入管子，觀察水面有無氣泡產(chǎn)生以確定管子有否滲漏和滲漏的部位。 試漏方法有兩種：氣壓試驗和水壓試驗。法蘭雖然易于拆卸更換，但聯(lián)接處有墊片易滲漏，而焊接則無此種現(xiàn)象。需要將管外壁的污垢鏟除后，將管子烘干，管內(nèi)加水壓，才能發(fā)現(xiàn)滲漏的部位。冷卻水的壓力通常大于罐壓，如果有微孔，冷卻水就會進入發(fā)酵液而引起染菌。所以冷卻管是發(fā)酵罐中最容易滲漏的部件之一。發(fā)酵液中含有固體物料時，固體物料因攪拌槳的攪動與冷卻管摩擦而引起管外壁磨損。這些漏孔很小，特別是不銹鋼材料形成的漏孔更小，有時肉眼不能直接覺察，需要通過一定的試漏方法才能發(fā)現(xiàn)。所以搖瓶機將成為放大發(fā)酵試驗過程中的一種更有效的工具。其優(yōu)點是氧的傳遞較好，功率消耗小，培養(yǎng)基不會濺到瓶口的紗布上。在三個偏心軸上裝有螺栓可調(diào)節(jié)上下，使托盤保持水平。 旋轉(zhuǎn)式搖瓶機是利用旋轉(zhuǎn)的偏心軸使托盤擺動，托盤有一層或兩層，可用不銹鋼板、銅板、塑料板或木板制造。但懸掛式搖瓶機如為多層時，每層的沖程不一樣，越是上層沖程越小。 根據(jù)支承裝置結(jié)構(gòu)不同，往復(fù)式搖瓶機分為滾輪式和懸掛式兩種。往復(fù)式搖瓶機的頻率和偏心距的大小對氧的吸收有明顯的影響。 往復(fù)式搖瓶機(圖72)是利用曲柄原理帶動搖床作往復(fù)運動，機身為鐵制或木制的長方形框子，有一層至三層托盤，托盤上開有圓孔備放培養(yǎng)瓶，孔中凸出一三角形橡皮，用以固定培養(yǎng)瓶并減少瓶的震動，傳動機構(gòu)一般采用二級皮帶輪減速，調(diào)換調(diào)速皮帶輪可改變往復(fù)頻率。放在搖瓶機上培養(yǎng)瓶中發(fā)酵液所需的氧是由室內(nèi)空氣經(jīng)瓶口包扎的紗布(一般是八層)或棉塞通入的，所以氧的傳遞與瓶口的大小，瓶口的幾何形狀和棉塞或紗布層的厚度和密度有關(guān)。往復(fù)式搖瓶機的往復(fù)頻率一般在80~140次／分，沖程一般為6~14厘米，如頻率過快、沖程過大或瓶內(nèi)液體裝料過多，在搖動