【正文】 業(yè)生產(chǎn)中對(duì)于大量的培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌，最有效、最常用的方法是蒸汽滅菌 (即濕熱滅菌 )。因?yàn)槔淇諝鈱?dǎo)熱性差，阻礙蒸汽接觸欲滅菌物品。 ? 含芽孢桿菌和霉菌孢子多的培養(yǎng)基，要適當(dāng)提高滅菌溫度或延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。 ? 培養(yǎng)基中微生物數(shù)量越多，達(dá)到無菌要求所需的滅菌時(shí)間也越長(zhǎng)。對(duì)易產(chǎn)生泡沫的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時(shí)，可加入少量消泡劑。 ? 越濃稠的培養(yǎng)基滅菌所需時(shí)間越長(zhǎng)。 ? 其原因在于液體培養(yǎng)基滅菌時(shí)，熱量傳遞是由傳導(dǎo)作用和對(duì)流作用完成的，而固體培養(yǎng)基只有傳導(dǎo)作用而沒有對(duì)流作用。 ? 溫度 孢子數(shù) 滅菌時(shí)間 (min) ? (℃ ) (個(gè) /ml) pH= ? 120 10000 8 7 5 3 3 ? 115 10000 25 25 16 13 13 ? 110 10000 70 65 35 30 24 ? 100 10000 740 720 180 150 150 73 二、影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素 ? 培養(yǎng)基的物理狀態(tài) ? 培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對(duì)滅菌有極大的影響。 在 ~生物最耐熱， pH，氫離子極易滲入細(xì)胞 內(nèi) ，從而改變細(xì)胞的生理反應(yīng)促進(jìn)其死亡，故 pH愈低，滅菌所需的時(shí)間愈短。 ? 在固形物含量高的情況下，滅菌溫度要高些。 滅菌溫度 /℃ 滅菌時(shí)間 /min 維生素 B1破壞量 /% 100 400 110 36 67 115 15 50 120 4 27 130 8 145 2 150 ＜ 1 一、溫度和時(shí)間對(duì)培養(yǎng)基滅菌的影響 71 二、影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素 培養(yǎng)基成分 ? 培養(yǎng)基中的油脂、糖類和蛋白質(zhì)增加微生物的耐熱性，使微生物的熱致死速率變慢，這主要是因?yàn)橛袡C(jī)物質(zhì)會(huì)在微生物細(xì)胞外形成一層薄膜，阻礙熱的傳入，因此應(yīng)提高滅菌溫度或延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。 ? 采用高溫快速滅菌方法，既可殺死培養(yǎng)基中的全部有生命的有機(jī)體，又可減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞。 ? 一般 化學(xué)反應(yīng)的 Q10為 ~， 殺滅微生物營(yíng)養(yǎng)體反應(yīng)的 Q10為 5~10， 殺死細(xì)菌芽孢的反應(yīng)的 Q10為 35左右。 ＞ E： 菌體死亡所需活化能 E39。 k1 k2 ln ln k139。： 營(yíng)養(yǎng)成分破壞所需活化能 一、溫度和時(shí)間對(duì)培養(yǎng)基滅菌的影響 RTEeAk /????k1 k2 k k 68 ? 由于殺死微生物的 E＞營(yíng)養(yǎng)成分破壞的 E ′，因此， ? 即隨溫度上升，滅菌反應(yīng)速度常數(shù)的增加倍數(shù)大于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分破壞速度常數(shù)的增加倍數(shù)。1→k39。 E 67 2. 為滅菌溫度和滅菌時(shí)間的選擇提供依據(jù)和指導(dǎo) 由 ，加熱滅菌時(shí)， 滅菌溫度發(fā)生變化 ，熱致死速度常數(shù) k 值和培養(yǎng)基成分分解反應(yīng)速度常數(shù) k39。 一般 E殺死微生物營(yíng)養(yǎng)體 =200~270kJ/mol E殺死微生物芽孢 ＞ 400kJ/mol E酶或維生素分解 ≈80kJ/mol lnK 1/T 高活化能的孢子死亡 低活化能營(yíng)養(yǎng)成分分解 孢子死亡和營(yíng)養(yǎng)成分降解中活化能影響 k k 66 名稱 E (J/mol) 葉酸 泛酸 維生素 B12 維生素 B1 嗜熱脂肪芽孢桿菌 枯草桿菌 肉毒梭狀芽孢桿菌 腐敗厭氣菌 NCA3679 部分微生物的致死活化能 E和營(yíng)養(yǎng)成分破壞的活化能 E39。)和 A(A39。以 lnk(lnk 39。 64 ? 熱滅菌致菌體死亡 也是一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)， 熱致死速度常數(shù) 與溫度的關(guān)系也可用阿累尼烏斯方程式表示： ? 式中 A滅菌反應(yīng)的阿累尼烏斯常數(shù) (1/s ) ΔE‘滅菌反應(yīng)所需的活化能 (J/mol)； 前兩式取對(duì)數(shù)，則得： 營(yíng)養(yǎng)成分的破壞方程式 菌體死亡方程式 RTEeAk /????一、溫度和時(shí)間對(duì)培養(yǎng)基滅菌的影響 k k 65 ? 阿累尼烏斯方程式的意義： 1. 反應(yīng)了反應(yīng)速度常數(shù) k 39。 39。 39。分解反應(yīng)所需的活化能 (J/mol)； 一、溫度和時(shí)間對(duì)培養(yǎng)基滅菌的影響 kC dt dC ? ? RTEeAk /????39。滅菌溫度和時(shí)間的確定取決于： ? （ 1）雜菌孢子的熱滅死動(dòng)力學(xué)； ? （ 2）反應(yīng)器的形式和操作方式； ? （ 3）培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接受范圍。 一、溫度和時(shí)間對(duì)培養(yǎng)基滅菌的影響 嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子死亡程度為 N/N0=1016時(shí)， 滅菌溫度對(duì)維生素 B1破壞的影響 滅菌溫度（ ?C） 達(dá)到滅菌程度的時(shí)間（ min） 維生素 B1的損失（ %） 100 110 120 130 140 150 843 75 89 27 10 3 1 61 一、溫度和時(shí)間對(duì)培養(yǎng)基滅菌的影響 滅菌溫度、滅菌時(shí)間和維生素 B1破壞量的比較 滅菌溫度 /℃ 滅菌時(shí)間 /min B1破壞量 /% 100 400 110 30 67 115 15 50 120 4 27 130 8 140 2 150 1 62 ? 因此， 選擇既能達(dá)到滅菌要求又能減少營(yíng)養(yǎng)成分破壞的滅菌溫度和時(shí)間，是提高培養(yǎng)基滅菌質(zhì)量的重要內(nèi)容。 59 問題怎么這么多？ ? 連消與實(shí)消各有何優(yōu)缺點(diǎn)？ ? 影響培養(yǎng)基滅菌因素有哪些？ ? 如何計(jì)算培養(yǎng)基滅菌時(shí)間？ ? 怎樣做到既要滅菌目的又要保護(hù)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分最少破壞？ ? 實(shí)消的過程要點(diǎn)和控制參數(shù)？ ? 連消的過程要點(diǎn)和設(shè)備組成？ 60 一、溫度和時(shí)間對(duì)培養(yǎng)基滅菌的影響 ? 用濕熱滅菌方法對(duì)培養(yǎng)基滅菌，在殺滅微生物的同時(shí)，也會(huì)對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分造成破壞。 ? 當(dāng)氣流速度達(dá)到一定值或過濾介質(zhì)使用時(shí)間太長(zhǎng)，介質(zhì)中滯留的雜菌微粒就有可能穿過，所以過濾器必須定期滅菌。 ? 如果要將雜菌完全除盡，即 NL=0，濾層厚度需要無窮大，事實(shí)上是不可能的。 55 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 ? 空氣在一定的條件下，通過單位高度介質(zhì)層后，雜菌數(shù)目的減少量與進(jìn)入此介質(zhì)層的雜菌數(shù)量成正比，即： ? —— = K N ? 式中 N— 進(jìn)入介質(zhì)層的菌的數(shù)目 (個(gè) )； ? L— 介質(zhì)層厚度 (m)； ? K— 過濾常數(shù)或除菌常數(shù) (1/m)； ? dN/dL— 單位高度過濾介質(zhì)層所除去的菌的數(shù)目 (個(gè) /米 )。 ? 2） 介質(zhì)的填充厚度與密度： 對(duì)于相同的介質(zhì)，填充厚度和密度越大則過濾效率越高，但同時(shí)流速也越小。 ? ? η=——— =1—— =1P Nt N0 N0 Nt N0 Nt N0 54 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 ? 空氣過濾器的過濾效率與微粒的大小、過濾介質(zhì)的種類和纖維直徑、介質(zhì)的填充密度、介質(zhì)層的厚度以及空氣通過介質(zhì)層的氣流速度等因素有關(guān)。 ? 空氣溫度 20℃ ，微粒重度 γp=時(shí)，通過不同直徑的纖維過濾層的空氣的臨界速度 (Vc)見右圖 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 53 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 ? 空氣過濾后的微粒數(shù)與過濾前的微粒數(shù)的比值稱為穿透率 P，則 ? P = —— ? 式中 N0— 過濾前空氣中的微粒含量 (個(gè) )； ? Nt— 過濾后空氣中的微粒含量 (個(gè) )。 當(dāng)氣流速度低于一定值時(shí) ， 以攔截作用和擴(kuò)散作用為主 ， 并可認(rèn)為慣性沖擊不起作用 ， 此時(shí)的氣流速度稱為臨界速度 (Vc)。 ? 過濾效率就是濾層所濾去的微粒數(shù)與原有微粒數(shù)的比值 ， 它是衡量過濾設(shè)備過濾能力的指標(biāo) 。 ? 一般認(rèn)為慣性沖擊 、 攔截和布朗擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)的作用較大 ，而重力沉降作用和靜電吸引的作用則很小 。 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 51 ? 在過濾除菌中 ， 有時(shí)很難分辨上述各種機(jī)理各自所做出貢獻(xiàn)的大小 ， 多是 五種作用的綜合結(jié)果 。 ? 帶電荷的微生物通過過濾介質(zhì)層時(shí)，可被具有相反電荷的纖維介質(zhì)吸引，而被吸附捕集；也可能是纖維介質(zhì)被流動(dòng)的帶電荷的粒子所感應(yīng)，產(chǎn)生相反的電荷而將粒子吸引。懸浮在空氣中的微生物顆粒大多帶有不同的電荷。 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 50 ? (5) 靜電吸引作用： 異性相吸。 ? 直徑 50μm以上的顆粒沉降作用比較顯著，小顆粒只有在氣流速度很慢時(shí)才有沉降作用。由于布朗擴(kuò)散截留作用的存在，大大增加了纖維的截留效率。結(jié)果使較小的微粒聚集成為較大的微粒，增加了與纖維接觸的機(jī)會(huì)，當(dāng)與纖維接觸時(shí)就被捕集，這種作用叫做 擴(kuò)散 。微粒被捕集的位置為 θ90o， 空氣流速較小時(shí)，攔截才起作用。 ? 微生物微粒直徑很小，質(zhì)量很輕，當(dāng)隨低速氣流流動(dòng)靠近纖維時(shí)，微粒所在的主導(dǎo)氣流流線受纖維阻礙而改變力向，繞過纖維前進(jìn)，并在纖維的周邊形成一層邊界滯留區(qū)。 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 47 ? (2)攔截截留作用 ：速度太慢動(dòng)能不足被吸附； ? 當(dāng)氣流速度較低時(shí)，微粒的運(yùn)動(dòng)軌跡與空氣流線相似。 ? 這種慣性沖擊作用的程度取決于微粒的動(dòng)能、纖維阻力、氣流速度。 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 46 ? （ 1）慣性沖擊截留作用 ：撞上去被吸附； ? 灰塵微粒有一定的質(zhì)量，因而在運(yùn)動(dòng)時(shí)有一定的慣性。 ? 帶微粒的空氣流過纖維濾層時(shí)， 懸浮于空氣中的微生物菌體何以能被過濾除去呢？ 45 ?當(dāng)氣流為層流時(shí)，氣體中的微粒隨空氣做平行運(yùn)動(dòng)，接近纖維表面的微粒 (指在流動(dòng)空氣寬度 b內(nèi)的微粒 )被纖維捕獲，而寬度大于 b的氣流中的微粒繞過纖維繼續(xù)前進(jìn)。 ? 如棉花纖維直徑一般為 16~20μm，充填系數(shù) (空氣過濾器內(nèi)過濾介質(zhì)的體積占過濾器總體積的百分率 )為 8%時(shí)，棉花纖維間形成的空隙為 20~50μm。 ? 常用的濾材介質(zhì)有棉花、棒狀活性炭、石棉板、超細(xì)玻璃纖維紙、燒結(jié)玻璃、粉末燒結(jié)金屬、硝酸纖維酯類物質(zhì)、多孔陶瓷、聚四氟乙烯薄膜、聚砜、尼龍膜等。 為適用于大量的空氣凈化處理，可用較大孔隙的纖維介質(zhì)等濾材組成深層過濾層，來去除極微小的懸浮微生物。細(xì)菌的大小為零點(diǎn)幾微米至幾微米，這些微生物在空氣中極少單獨(dú)游離存在，基本都是附著在灰塵、液滴等微粒的表面上。在空氣過濾之前應(yīng)設(shè)預(yù)過濾器將空氣中的油、水除去，以提高微孔濾膜的過濾效率和使用壽命。 ? 絕對(duì)過濾易于控制過濾后空氣質(zhì)量，節(jié)約能量和時(shí)間，操作簡(jiǎn)便。對(duì)動(dòng)物細(xì)胞血清培養(yǎng)基選用 0 1μm孔徑的濾膜來除去支原體的污染。 第一節(jié) 滅菌和除菌的基本原理 絕對(duì)過濾 深層過濾 40 絕對(duì)過濾 ? 絕對(duì)過濾最常用的過濾材料是微孔濾膜。 ? 按過濾除菌機(jī)制不同而分為 ? 兩者原理是不同