【正文】 長將影響發(fā)酵的正常進行或影響產(chǎn)物的提取時，應該提早放罐。對于發(fā)酵周期短的菌株、突變影響小的發(fā)酵，采用保壓不進行空罐滅菌的辦法是可行的，但經(jīng)一定發(fā)酵批數(shù)后仍需定期進行空罐滅菌，否則較難避免雜茵污染與遺傳突變的影響。有些工廠為了節(jié)約蒸汽，直接進行實罐滅菌而不進行空罐滅菌，他們只有在檢修后或在節(jié)日停工后以及春夏季節(jié)發(fā)酵罐空置了24小時以上時才進行空罐滅菌。所以在發(fā)生泡沫時應加以清除(加消泡劑和在操作上予以控制)?？傊瑴缇鷷r蒸汽壓力要求平穩(wěn)，在壓力變動較大時，操作人員需靈活掌握加以控制。根據(jù)操作經(jīng)驗，能否達到徹底滅菌的目的在于罐內壓力能否控制得與應該達到的溫度相對應，例如罐壓已達到1公斤/厘米2而料溫卻并未達到120℃，則某些耐熱的細菌芽孢就難以完全殺死。 超細玻璃纖維紙的周圍密封要可靠，空氣閥和蒸汽閥要緩開緩閉，避免因流速突然升高將過濾紙擊穿。 過濾器滅菌用的蒸汽閥的微小滲漏會使蒸汽管路中的冷凝水抽吸到過濾器內使過濾介質受潮，影響過濾效果，所以最好裝設雙重閥以防滲漏。要根據(jù)發(fā)酵的特點和要求選用合理的空氣流程并選用高效的氣液分離設備(如氣液過濾網(wǎng))。之后，灰化的活性炭隨氣流逸出，整個過濾介質的體積減小使過濾層傾斜甚至發(fā)生翻身的現(xiàn)象，致使大量未經(jīng)過濾的空氣進入發(fā)酵罐內造成嚴重的染菌事故。對于棉花過濾器最合適的充填密度是160~180公斤／米3；玻璃纖維是130~180公斤／米3左右。走短路的那部分空氣沒有經(jīng)過充分過濾而帶菌，進入發(fā)酵罐將使發(fā)酵染菌。另外排氣管的直徑太大，滅菌時蒸汽流速小也會使管中部分耐熱菌不能全部殺死。利用注射器在罐的接種口橡皮膜上注入罐內進行接種，在操作時要注意防止注射器針孔堵塞。 采用復合鋼板(將兩種不同材質的鋼板軋合為一體的鋼板)制造發(fā)酵罐，因為兩層鋼板緊密結合在一起，中間沒有空隙，所以不會產(chǎn)生上述問題，是一種理想的材料。所以對于不銹鋼襯里設備加工時應該盡可能增加襯里的剛度，其辦法是每隔一定距離用點焊增加襯里與鋼制殼體的連接強度，減少鼓起的可能性。3，不銹鋼襯里的死角 某些有機酸的發(fā)酵對碳素鋼有腐蝕時，小型發(fā)酵罐通常采用不銹鋼制造。如果在底軸承下增設一個小型攪拌槳就可以適當改善罐底積垢的情況(圖710)。2，渣滓在罐底與用環(huán)式空氣分布管所形成的死角 培養(yǎng)基中如果含有鈣鹽類及固形物，在發(fā)酵罐的攪拌功率較小和采用環(huán)式空氣分布管的情況下，由于在滅菌時培養(yǎng)基得不到強有力的翻動，罐底會形成一層1—2毫米甚至更厚的膜層(圖79)?，F(xiàn)將經(jīng)常出現(xiàn)死角的場合及形成死角的幾種原因介紹如下：1，法蘭連接的死角如果對染菌的概念了解不夠，按照一般化工廠管路的常規(guī)加工方法來焊接和安裝管道法蘭就會造成死角。在滅菌操作時，將旁路閥門打開，使蒸汽自由通過。倘若使用一根總的排氣管時，必須選擇較大直徑的管子，保證排氣下水通暢不致倒回到發(fā)酵罐內。（三）管路的配置 1，排氣管與下水管發(fā)酵廠中若干發(fā)酵罐的排氣管路大多匯集在一條總的管路上，以節(jié)約管材，下水管亦然。 （3）焊接焊接的方法比其他方法簡便，而且密封可靠。由于管路受冷熱和震動的影響，活接頭的接口易松動，使密封面不能嚴密而造成滲漏。但須定期檢查隔膜有否老化及脫落。隔膜閥有以下優(yōu)點： 1)嚴密不漏。閥門在使用一定時間后，閥桿磨損或填料損壞也會引起滲漏，就需要將填料壓蓋適當擰緊或更換填料。截止閥在使用中經(jīng)常發(fā)生以下兩個問題： ①閥心軋壞。 （1）截止閥(圖76) 閥體為橫放的S形，閥座與閥心的接觸面小，污物不易附在上面，但構造比較復雜，流體阻力較大。所以，與發(fā)酵有關的管路不能同一般化工廠的化工管路完全一樣，而有其特殊的要求。有夾套的發(fā)酵罐可在夾套內用水壓或氣壓的試驗方法檢查罐壁有無滲漏。采用不銹鋼制造的冷卻管，耐腐蝕情況比普通鋼管要好得多，產(chǎn)生漏孔的機會也比普通鋼管少。 試漏方法有兩種：氣壓試驗和水壓試驗。需要將管外壁的污垢鏟除后，將管子烘干，管內加水壓，才能發(fā)現(xiàn)滲漏的部位。所以冷卻管是發(fā)酵罐中最容易滲漏的部件之一。這些漏孔很小，特別是不銹鋼材料形成的漏孔更小，有時肉眼不能直接覺察，需要通過一定的試漏方法才能發(fā)現(xiàn)。其優(yōu)點是氧的傳遞較好，功率消耗小，培養(yǎng)基不會濺到瓶口的紗布上。 旋轉式搖瓶機是利用旋轉的偏心軸使托盤擺動，托盤有一層或兩層，可用不銹鋼板、銅板、塑料板或木板制造。 根據(jù)支承裝置結構不同，往復式搖瓶機分為滾輪式和懸掛式兩種。 往復式搖瓶機(圖72)是利用曲柄原理帶動搖床作往復運動，機身為鐵制或木制的長方形框子，有一層至三層托盤，托盤上開有圓孔備放培養(yǎng)瓶，孔中凸出一三角形橡皮，用以固定培養(yǎng)瓶并減少瓶的震動，傳動機構一般采用二級皮帶輪減速，調換調速皮帶輪可改變往復頻率。往復式搖瓶機的往復頻率一般在80~140次／分，沖程一般為6~14厘米，如頻率過快、沖程過大或瓶內液體裝料過多，在搖動時液體要濺到包瓶口的紗布上易引起染菌，特別是啟動時更易發(fā)生這種情況。 通入蒸汽后使瓶內培養(yǎng)基溫度達到121186。滅菌操作時需要注意排氣管是否暢通，因為滅菌鍋的排氣管較小，易被鐵銹或瓶子破碎后的培養(yǎng)基等所堵塞。 在種子的無菌條件不要求很高的情況下，可以不采用無菌室而直接用無菌箱進行操作，但無菌要求很高的情況下，即使在無菌室內還要用無菌箱操作。無菌室的立視圖配合使用的化學滅菌藥劑有：用作噴灑或揩擦的(以揩擦為主)有75%酒精、%新潔而滅(季胺鹽)、~1%漂白粉、%石炭酸、%過氧乙酸、1%煤酚皂(來蘇爾)、%高錳酸鉀、300單位/毫升土霉素、50單位/毫升制霉菌素等；用作熏蒸的有甲醛(每立方米空間約用10毫升)或硫磺(每立方米空間約用2~3克)。無菌室的每個套間一般都用紫外線滅菌。（1）無菌室接種、移種等無菌操作需要在無菌室內進行。第四節(jié)發(fā)酵染菌的防止一、種子帶菌的原因及防止1，帶菌的原因（1）無菌室的無菌條件不符合要求；（2）培養(yǎng)基滅菌不徹底；（3）操作不當。污染霉菌大多是滅菌不徹底或無菌操作不嚴格所致。5，從染菌的類型來分析所染雜菌的類型也是判斷染菌原因的重要依據(jù)之一。 （3）個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌和偶然染菌個別發(fā)酵罐連續(xù)染菌大多是由設備問題造成的，如閥門的滲漏或罐體腐蝕磨損，特別是冷卻管的不易覺察的穿孔等。所以對于空氣系統(tǒng)必須定期經(jīng)常檢查。1，國外一抗生素發(fā)酵染菌原因的分析染菌原因百分率（%）染菌原因百分率（%）種子帶菌 接種時罐壓跌零 培養(yǎng)基滅菌不透 空氣系統(tǒng)帶菌 攪拌軸密封泄漏 泡沫冒頂 夾套穿孔 蛇管穿孔 接種管穿孔 閥門泄漏 罐蓋漏 其他設備漏 操作問題 原因不明 2，國內一制藥廠發(fā)酵染菌原因的分析染菌原因百分率（%）外界帶入雜菌（取樣、補料帶入）設備穿孔空氣系統(tǒng)帶菌停電罐壓跌零接種蒸汽壓力不夠或蒸汽量不足管理問題操作違反規(guī)程種子帶菌原因不明上述資料是國內外抗菌素生產(chǎn)中統(tǒng)計了多年生產(chǎn)中發(fā)生染菌現(xiàn)象的各種原因所占的百分比，今列出以供參考。但在發(fā)酵生產(chǎn)中，往往因為生產(chǎn)過程的環(huán)節(jié)很多，同時各工廠的生產(chǎn)設備、產(chǎn)品種類和管理措施不盡相同，引起染菌的原因比較復雜，有時不能及時找出而耽誤了生產(chǎn)。6，操作染菌率：統(tǒng)計操作工的染菌率，一方面可以分析染菌原因，另一方面可以考核操作工的滅菌操作技術水平。3，不同品種發(fā)酵的染菌率：統(tǒng)計不同品種發(fā)酵的染菌率，有助于查找不同品種發(fā)酵染菌的原因。 本節(jié)將根據(jù)以往工廠中發(fā)生染菌事故的經(jīng)驗教訓來分析發(fā)酵系統(tǒng)中染菌的原因，來認識整個發(fā)酵過程中可能造成污染的各種途徑并提出相應的防治措施。因此，染菌問題是影響產(chǎn)率和后工序操作的主要因素之一，必須予以重視。發(fā)酵設備、空氣除菌系統(tǒng)和培養(yǎng)基滅菌系統(tǒng)等的有關設備以及管道的配置都必須嚴格符合無菌要求。檢查的一般時間或工序見下表。三，雜菌檢查中的問題1，檢查結果應以平板劃線和肉湯培養(yǎng)結果為主要根據(jù)2，平板劃線和肉湯培養(yǎng)應做三個平行樣3，要定期取樣4，酚紅肉湯和平板劃線培養(yǎng)樣品應保存至放罐后12小時，確定為無菌時方可棄去5，取樣時防止外界雜菌混入的措施四，檢查的工序和時間選擇那些生產(chǎn)工序和時間的樣品檢查也是十分重要的問題。目前生產(chǎn)上常用的檢查方法有：①顯微鏡檢查；②平板劃線檢查；③肉湯培養(yǎng)檢查。（2）對產(chǎn)品外觀的影響：一些染菌的發(fā)酵液經(jīng)處理過濾后得到澄清的發(fā)酵液，放置后會出現(xiàn)混濁，影響產(chǎn)品的外觀。如污染嚴重，可采取措施提前放罐四，不同染菌途徑對發(fā)酵的影響種子帶菌：種子帶菌可使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性空氣帶菌：空氣帶菌也使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性，導致染菌范圍擴大至所有發(fā)酵罐培養(yǎng)基或設備滅菌不徹底：一般為孤立事件，不具有延續(xù)性設備滲漏：這種途徑造成染菌的危害性較大五，染菌對產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質量的影響1，對過濾的影響發(fā)酵液的粘度加大；菌體大多自溶；由于發(fā)酵不徹底，基質的殘留濃度加度。 所謂“雜菌”， 是指在發(fā)酵培養(yǎng)中侵入了有礙生產(chǎn)的其他微生物。尤其是無菌程度要求高的液體深層發(fā)酵，污染防止工作的重要性更為突出。一，染菌對不同品種發(fā)酵的影響青霉素疫苗檸檬酸谷氨酸肌苷、肌苷酸酶制劑二，不同種類的雜菌對發(fā)酵的影響青霉素發(fā)酵：污染細短產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大鏈霉素發(fā)酵：污染細短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大四環(huán)素發(fā)酵：污染雙球菌、芽孢桿菌和夾膜桿菌的危害較大檸檬酸發(fā)酵：最怕污染青霉菌肌苷、肌苷酸發(fā)酵：污染芽孢桿菌的危害最大谷氨酸發(fā)酵：最怕污染噬菌體高溫淀粉酶發(fā)酵：污染芽孢桿菌和噬菌體的危害較大三，不同染菌時間對發(fā)酵的影響1，種子培養(yǎng)期染菌菌體濃度低、培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富2，發(fā)酵前期染菌雜菌與生產(chǎn)菌爭奪營養(yǎng)成分，干擾生產(chǎn)菌的繁殖和產(chǎn)物的形成3，發(fā)酵中期染菌嚴重干擾生產(chǎn)菌的繁殖和產(chǎn)物的生成4，發(fā)酵后期染菌如雜菌量不大，可繼續(xù)發(fā)酵。對產(chǎn)品的純度有較大影響。檢查雜菌的方法，要求淮確可靠和快速，這樣才能在短時間內獲得效果。平板劃線法的缺點是需經(jīng)較長時間培養(yǎng)(一般要過夜)才能判斷結果，且操作較繁瑣，但它要比顯微鏡能撿出更少的雜菌。由于生產(chǎn)菌種相產(chǎn)品的不同，檢查的時間也不完全一樣：但總的原則是一致的，即每個工序或經(jīng)一定時間都應進行取樣檢查。尤其是無菌程度要求高的液體深層發(fā)酵，污染防止工作的重要性更為突出。在發(fā)酵后期染菌，雖然沒有早期或中期染菌的影響大，一般會使產(chǎn)率下降并影響產(chǎn)物的提取，但如核苷酸等某些產(chǎn)品的發(fā)酵即使在后期染菌，也會使發(fā)酵產(chǎn)物被所染雜菌迅速消耗掉而得不到產(chǎn)品。只要我們思想上重視，對各個因素和環(huán)節(jié)周密考慮、嚴格掌握，是完全可以避免和減少污染的。2，設備染菌率：統(tǒng)計發(fā)酵罐或其他設備的染菌率，有利于查找因設備缺陷而造成的染菌原因。5，季節(jié)染菌率：統(tǒng)計不同季節(jié)的染菌率，可以采取相應的措施制服染菌。 如果一旦發(fā)生染菌現(xiàn)象就要盡快找出原因及時糾正、堵塞漏洞才能減少損失，并從中吸取經(jīng)驗教訓，避免以后有類似情況發(fā)生，保持生產(chǎn)的正常進行。下面根據(jù)發(fā)酵工廠的生產(chǎn)經(jīng)驗，從一般染菌的現(xiàn)象來分析引起染菌的可能原因。大批發(fā)酵罐染菌的現(xiàn)象較少但危害極大。另外，采用培養(yǎng)基連續(xù)滅菌系統(tǒng)時，那些用連續(xù)滅菌進料的發(fā)酵罐都出現(xiàn)染菌，可能是連消系統(tǒng)滅菌不徹底所造成的。4，從染菌的時間來分析發(fā)酵早期染菌，一般認為除了種子帶菌外，還有培養(yǎng)液滅菌或設備滅菌不徹底所致，而中、后期染菌則與這些原因的關系較少，而與中間補料、設備滲漏以及操作不合理等有關。在檢查時如平板上出現(xiàn)的是淺綠色菌落(革蘭氏陰性桿菌)，由于這種菌主要生存在水中，所以發(fā)酵罐的冷卻管或夾套滲漏所引起的可能性較大。”我們不能機械地認為某種染菌現(xiàn)象必然是從某一途徑引起的，應該把染菌的位置、時間和雜菌的類型等各種現(xiàn)象加以綜合分析，才能正確判斷從而采取相應的對策和措施。種子培養(yǎng)的設備和裝置有無菌室、滅菌鍋和搖瓶機等。無菌室內部的墻壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求無裂縫，墻角最好做成圓弧形，便于揩擦清洗以減少空氣中微生物的潛伏場所，室內布置應盡量簡單，最好能安裝空氣調節(jié)裝置，通入無菌空氣并調節(jié)室內的溫濕度。紫外線能穿過石英但不能透過玻璃。 無菌室內無菌度的要求是：把無菌培養(yǎng)皿平板打開蓋子在無菌室內放置30分鐘，根據(jù)一般工廠的經(jīng)驗，長出的菌落在3個以下為好。（2）滅菌鍋 滅菌鍋是一種壓力容器，作為培養(yǎng)種子及小型試驗用具的滅菌之用，有立式和臥式兩種。如果不是采用蒸汽而是用鍋內燒水的辦法進行滅菌，那末排氣的時間更要長一些，不然水蒸汽來不及驅出空氣而使被滅菌的瓶中的冷空氣排不盡。 （3）搖瓶機 搖瓶機(亦稱搖床)是培養(yǎng)好氣菌的小型試驗設備或作為種子擴大培養(yǎng)之用，常用的搖瓶機有往復式(圖72)和旋轉式(圖74)兩種。在通常情況下，搖瓶的氧吸收系數(shù)(亞硫酸氧化值)Kd取決于搖瓶機的特性和三角瓶的裝料量，見表72。據(jù)有關文獻報導，當沖程為10厘米、往復頻率為200次/分，分，大氣壓；當沖程為5厘米、往復頻率240次/分時，分，大氣壓。故使用多層懸掛式搖瓶機時應予注意。此種搖瓶機結構比較復雜，加工安裝要求比往復式高，造價也較貴。二、發(fā)酵設備、管件的滲漏與配置設備和管件的滲漏一般是指設備和管件由于腐蝕、內應力或其他原因形成微小漏孔所發(fā)生的滲漏現(xiàn)象。管內冷卻介質一般為井水或自來水，因水的化學成分和流動時的沖擊以及加熱時蒸汽沖擊的影響，管內壁也會引起腐蝕及磨損。 檢查列管有否滲漏，在漏孔極其微小時是不易發(fā)現(xiàn)的。為了及早發(fā)現(xiàn)漏孔予以排除，冷卻管要定期檢查作滲漏試驗。氣壓法快速方便，但管子下部彎曲處積水不易排盡，有漏孔時不產(chǎn)生氣泡就難以發(fā)現(xiàn)。每年大修時需檢查鋼板減簿的程度。管道的連接方式、按裝方法以及選用的閥門形式對防止污染有很大的關系。目前使用