【正文】 溫培養(yǎng) 1d；(3)菌種初篩得到高產(chǎn)菌株是一項工作量浩大，獲得幾率低的工作，因此在得到最優(yōu)稀釋度后，要從不同樣品中進行大量的菌種分離操作，并從中挑取菌落形態(tài)不同且長勢較好的單菌落于初篩培養(yǎng)基中進行劃線，并置于 28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1d，初篩階段至少得到 30 株菌株并接種于斜面培養(yǎng)基中 4℃低溫保存，以待下一步復篩篩選高產(chǎn)菌株；(4)菌種復篩以 3%的接種量將上述分離出的菌株分別接種于 250mL 三角瓶（50ml 裝量）的復篩（產(chǎn)酶）培養(yǎng)基中，并相應(yīng)標記，28℃，180r/min 搖床培養(yǎng) 48h，然后用 DNS 比色法測酶活力，比較篩選出酶活力最高的菌株；并將篩選出的高產(chǎn)菌株接種于斜面培養(yǎng)基中 4℃低溫保存。因此本研究針對這一問題，對耐低溫菊粉酶產(chǎn)生菌進行高產(chǎn)菌株的分離，并針對分離菌種產(chǎn)菊粉酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究，以期能夠得到低溫下即可分泌菊粉酶的高產(chǎn)菌株，實現(xiàn)菊粉酶的工業(yè)應(yīng)用普及。外切酶水解蔗糖的活力與轉(zhuǎn)化酶相同，內(nèi)切酶兒乎不水解蔗糖，Hg 2+、Ag +、Mn +強烈抑制酶活，說明酶活性中心有SH 基因， Ca2+使酶活增加，吲哚乙酸、EDTA ,磷酸毗哆醇對酶活沒有顯著影響 [9]。 菊粉酶為糖蛋白，含糖量為 26%37%，低聚糖以糖苷鍵的形式與酶蛋白中的天門冬酰胺殘基相連，純化后的菊粉酶在 SDSPAGE 和活性電泳中表現(xiàn)出幾條譜帶是出于各組分含糖量不同所造成的，用 EndoH 去除酶蛋白中的糖后，在電泳中得到單一譜帶 [13]。 菊粉酶的純化對于混合酶，酶的純化步驟一般分為:(NH) 2SO4 沉淀、離子交換層析及凝膠過濾色譜等。Margaruttes 報道酵母有 25%的酶在胞外，75% 在胞壁和胞內(nèi) [11]。(5)溫度的影響克魯斯假絲酵母(Candidacrusei) 產(chǎn)酶的最適溫度為 2730℃，溫度提高將導致產(chǎn)酶量降低。Kin 等人研究了各種無機氮源對青霉菌(Penicillium)產(chǎn)菊粉酶的影響，蛋白胨和玉米漿作氮源能提高產(chǎn)酶量，而脲和酵母膏影響不大 [22]。Gupta 等人發(fā)現(xiàn)用從菊芋根中提取出來的果聚糖作碳源(開花前含很少量的葡萄糖和果糖)，比用菊粉作碳源，酶活力有很大提高 [9]。大多數(shù)的研究結(jié)果一致認為，以菊粉作為碳源比以其它糖作碳源產(chǎn)菊粉酶活力高，且不同碳源對野生菌株和誘變菌株的影響不同。篩選出來的野生菌株往往酶活很低，且許多酵母和真菌合成菊粉酶的能力受到分解代謝物的抑制因此，須對野生菌株進行誘變，以篩選出產(chǎn)酶活高的菌株以 2脫氧 D葡萄糖作為篩子，因為它與葡萄糖結(jié)構(gòu)類似，且不能被微生物代謝利用，能夠在該培養(yǎng)基上生長的菌株為解除阻遏菌株。在這些微生物中黑曲霉(Aspergilliusniger)，無花果曲霉() ，不僅產(chǎn)外切酶和內(nèi)切酶，而且還產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶 [1,7]。利用菊粉酶直接發(fā)酵菊粉，制作功能性食品和飼料添加劑將有巨大的生產(chǎn)開發(fā)潛力。國外有報道指出，用 （一種酵母菌株）或 (一種酵母菌株)發(fā)酵菊粉生產(chǎn)酒精，（一種黑曲霉菌株）轉(zhuǎn)化率為 90%以上(v/v)，后兩者幾乎能完全將菊粉發(fā)酵成酒精。比利時 orafti 公司投資 20 億比利時法郎，歷時數(shù)十年種植菊藝開發(fā)生產(chǎn)低聚果糖和菊粉，分別作為食糖和油脂代用品 [21]。80 年代，美國、法國、比利時、加拿大等國的研究人員利用菊粉酶制果糖，其工藝簡單，轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物純，果糖產(chǎn)量高，可直接生產(chǎn)超高果葡糖漿，果糖含量 90%以上 [17]。研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的菊粉、麥芽糖和低濃度的果糖能夠誘導生成菊粉酶，淀粉對菊粉酶的影響不大，葡萄糖卻能明顯地抑制菊粉酶活性，這表明菊粉酶有底物專一性 [9]。 菊粉酶的理化性質(zhì)(1)熱穩(wěn)定性：菊粉酶最適溫度在 5264℃之間，5558℃最適宜；(2)最適 pH：菊粉酶最適 pH 為弱酸性，這一性質(zhì)不僅操作安全，而且使用過程中可以防止微生物污染，也是果糖最穩(wěn)定的 pH 值 [10]；(3)底物專一性：使用菊芋提取液或菊粉做碳源，都能誘導產(chǎn)生菊粉酶，但菊芋提取液作底物效果更好。一般認為外切菊粉酶的 I/s 值比內(nèi)切菊粉酶的 I/s 低。目前對菊粉酶的研究已引起了越來越多的學者的重視。 菊粉酶概述 菊粉酶的簡介菊粉酶(inulinase)是能夠水解 β2,1D果聚糖果糖苷鍵的一類水解酶，學名 β2,1D果聚糖酶，又叫 β果聚糖酶， β2,1D果聚糖水解酶，可以在一定的溫度條件下水解菊粉成果糖或低聚果糖 [10]。目前均停留于實驗室階段，限制因子在于：產(chǎn)酶菌株菊粉酶產(chǎn)量低，產(chǎn)酶成本高。本研究從低溫保存的腐爛菊芋上分離出耐低溫菊粉酶產(chǎn)生菌，以 DNS 比色法從 33株菌株中篩選出菊粉酶高產(chǎn)菌株即 2 號菌株，其酶活力為 ；通過 PlackettBurmen 試驗從豆粕添加量，菊粉添加量，(NH 4) 2SO4 添加量，磷酸氫二鉀添加量，吐溫添加量，氯化鎂添加量，初始 pH 值，氯化鈣添加量中篩選出影響發(fā)酵過程中菊粉酶活力的主要因素，即為豆粕添加量、初始 pH 值及氯化鈣添加量，再通過設(shè)計響應(yīng)面試驗探究其最優(yōu)發(fā)酵條件為：豆粕添加量 %，菊粉添加量 2%，(NH 4)2SO4 %，磷酸氫二鉀%，吐溫 %，氯化鎂 %，初始 pH 值 ，氯化鈣添加量 %；得到的此最佳發(fā)酵條件下的酶活力為 。目前國外對微生物菊粉酶進行了許多研究，包括菌種的篩選、產(chǎn)酶條件及酶的性質(zhì)的研究等，我國關(guān)于菊粉酶的研究目前還停滯在實驗室階段，由于酶的產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高還未進行工業(yè)化應(yīng)用,因此進一步篩選性能優(yōu)良的高產(chǎn)酶菌株仍然十分重要。it enzyme activity is Key words:inulin enzyme；h ighyielding strains；optimal fermentation conditions目錄1 引言 ........................................................................................................................1 菊粉酶概述 .........................................................................................................3 研究現(xiàn)狀 .............................................................................................................6 研究的目的意義 ................................................................................................62 材料與方法 ............................................................................................................7 樣品 ....................................................................................................................7 培養(yǎng)基 ................................................................................................................7 主要試劑 ......................................................7 主要儀 器設(shè)備 .....................................................................................................8 技術(shù)路線及操作要點 .........................................................................................8 技術(shù)路線 ..........................................................................................................8 操作要點 ..........................................................................................................9 研究內(nèi)容 ...........................................................................................................10 菌種分離 ........................................................................................................10 菌種篩選 ........................................................................................................11 發(fā)酵條件優(yōu)化研究 ........................................................................................11 菊粉酶活力的測定方法 ..................................................................................123 試驗結(jié)果與 分析 ..................................................................................................15 菌種分離 ........................