【正文】 其中微生物侵染是導(dǎo)致食物腐敗變質(zhì)的主要因素。 目前，用于各類食品防腐保鮮的方法主要有物理和化學(xué)的方法。 由于物理和化學(xué)方法在實際生產(chǎn)應(yīng)用中存在一定局限性，迫切需要尋求更安全有效的防腐保鮮新技術(shù)。 河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 生防微生物概況 用于生物防治的微生物種類 利用微生物進行各類食品的防腐保鮮就是選取不會對食品造成危害的微生物來抑制病原微生物的生長繁殖，從而達到防止食品腐敗變質(zhì)或降低食品腐敗變 質(zhì)程度的目的，目前研究較多的生防微生物主要有芽孢桿菌 (Sharma et al, 20xx)、乳酸菌 (Jiang et al, 20xx)、放線菌 (Subramaniam et al, 20xx)、酵母菌 (Droby et al, 20xx)及霉菌 (Ippolito A et al, 20xx)等，如表 11 所示?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，生防微生物菌株對有害微生物的作用方式主要有拮抗作用、寄生作用、競爭作用和誘導(dǎo)抗性等。范青等的研究表明枯草芽孢桿菌 B912 對柑橘采后青霉病和綠霉病具有較好的抑制效果，菌株 B912 的抑菌機理主要是產(chǎn)生抗菌素 (范青等 , 20xx)。王亮等的研究表明梅奇酵母 XY201在冬棗表皮具有很強的定殖能力，在人工氣調(diào)條件下貯藏，梅奇酵母 XY201 能有效抑制冬棗黑斑病的發(fā)生，使發(fā)病率降低 %%(王亮等 , 20xx)。研究發(fā)現(xiàn)，出芽短梗霉 (Ippolito A et al, 20xx)、畢赤酵母 (Fan et al, 20xx)、假絲酵母 (Ghaouth et al, 20xx )、枯草芽孢桿菌 (Ongena, 20xx)等均能誘導(dǎo)多種果蔬發(fā)生生理生化反應(yīng)，提高果蔬自身的抗性，減少其在采后貯藏期的腐爛。楊震等的研究結(jié)果表明采用 1108 CFU/mL 的枯草芽孢桿菌 BS331 菌懸液浸泡油桃可達到與納他霉素 (300 mg/L)相當(dāng)?shù)姆乐斡吞也珊蟛『Φ男Ч?(楊震等 , 20xx)。趙德立等研究發(fā)現(xiàn)多粘芽孢桿菌 JW2725 對柑橘青霉菌具有很強的拮抗作用 (趙德立等 , 20xx)。其中脂肽類抑菌物質(zhì)由于具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、抑菌活性高、抑菌譜廣等優(yōu)點而成為研究開發(fā)的熱點。 Naruse et al, 1990)，如圖 11 所示 。 呂應(yīng)年等 , 20xx。 河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 6 圖 12 Iturins 基本結(jié)構(gòu) Fengycins 是另一類具有抗真菌活性的脂肽，主要包括 Fengycin A 、 B，Plipastatin A 、 B，如圖 13 所示 (Schneider, 1999)。這就使得越來越多的國內(nèi)外學(xué)者把目光投向了天然防腐劑的開發(fā)利用，而微生物因具有生長繁殖快、生長條件簡單、易于分離培養(yǎng)等優(yōu)點已成為天然防腐劑研究開發(fā)的熱點。 LB 培養(yǎng)基 (LB)：蛋白胨 10g、酵母膏 5g、氯化鈉 10g、蒸餾水 1000 mL、pH ，用于細菌的液體培養(yǎng)。在無菌條件下，用無菌水對樣品懸液進行梯度稀釋，得到 101~108 濃度的稀釋液。分別取 20mL 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液，同 200mL 冷卻至55℃ 左右的 NA 培養(yǎng)基充分混勻后倒平板，待其凝固后，分別于距離平板中央 處的四個點上放置四個已滅菌的直徑 8mm 的 濾紙片，然后緩慢向濾紙片滴加 15μL待測細菌菌懸液，以 15μL無菌水作為對照。每個處理重復(fù) 3次， 28℃ 恒溫培養(yǎng) 5d，定期查看病原真菌的生長情況，測量并記錄抑菌帶寬。 拮抗菌株的復(fù)篩 采用牛津杯法 (foldes, 20xx)對初篩得到的抑菌效果較好的拮抗菌株進行復(fù)篩。 拮抗菌株生理生化特性分析 參照《常見細菌系 統(tǒng)鑒定手冊》 (東秀珠和蔡妙英， 20xx)進行拮抗菌株的生理生化試驗，包括需氧性、運動性、生長溫度、葡萄糖發(fā)酵試驗、過氧化氫酶試驗、 VP 試驗、淀粉水解試驗、檸檬酸鹽利用試驗、酪蛋白水解試驗、硝酸鹽還原試驗、耐鹽性試驗、纖維素降解試驗、明膠液化試驗、尿素利用試驗、吲哚試驗、 營養(yǎng)肉湯生長試驗等。 16S rDNA 序列擴增 以 16S rDNA 通用引物 27F 和 1492R 為引物，以提取得到的拮抗菌株基因組DNA 為模板對拮抗菌株的 16S rDNA 進行 PCR擴增。 系統(tǒng)發(fā)育分析 將測序結(jié)果與 GenBank 數(shù)據(jù)庫中已有的 16S rDNA 序列進行 BLAST比對，并利用軟件 MEGA 構(gòu)建 NeighborJoining系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株 LM210菌株 LM231菌株 L231菌株 DT0504 及菌株 DT2105 對供試病原真菌具有較好抑制能力，對細菌無抑菌活性。綜合比較初篩及復(fù)篩結(jié)果可知，菌株LM2303 廣譜拮抗效果最好，故選取菌株 LM2303 進行后續(xù)研究。 6177。 177。 177。 DT2101 5177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 DZ0503 177。 177。 。 177。 177。 177。 177。 177。 DT1806 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 表 28 拮抗菌株復(fù)篩結(jié)果 菌株 抑菌帶寬 /mm LM2303 177。其中菌株 LM230 菌株 DT210 菌株 RST190 菌株 DT180 菌株 DT180 菌株 DZ020 菌株 DZ0503 對 7 株供試病原菌具有廣譜拮抗效果，故選取這 7 株細菌進行拮抗菌株的復(fù)篩。 表 26 細菌菌株分離結(jié)果 樣品 菌株編號 菌株數(shù) LM07 LM0701LM0709 9 BH03 BH0301BH0311 11 BH04 BH0401BH0407 7 LM08 LM0801LM0805 5 LM19 LM1901LM1907 7 LM21 LM2101LM2108 8 LM23 LM2301LM2312 12 DT02 DT0201DT0204 4 DT05 DT0501DT0505 5 DT06 DT0601DT0606 6 DT18 DT1801DT1806 6 DT19 DT1901DT1909 9 DT21 DT2101DT2112 12 RST19 RST1901RST1910 10 SQ03 SQ0301SQ0305 5 DZ02 DZ0201DZ0208 8 DZ05 DZ0501DZ0509 9 DZ06 DZ0601DZ0609 9 ddH20 12μL 模板 1μL 引物 1 1μL 引物 2 1μL 2Taq Plus PCR Green Mix 15μL 總體系 30μL 廣譜高效微生物防腐劑產(chǎn)生菌的篩選及應(yīng)用 15 拮抗菌株初篩 采用濾紙片法或平板對峙培養(yǎng)法對分離純化得到的 142株細菌菌株進行拮抗菌株的初步篩選，初步篩選得到具有抑菌效果的拮抗菌株 23 株，結(jié)果見表 27。 PCR 反應(yīng)條件為， 95℃ 預(yù)變性 3min； 95℃ 變性 50S， 52℃ 退火50S， 72℃ 延伸 2min， 30 個循環(huán)； 72℃ 延伸 10min。取拮抗菌株培養(yǎng)液 1mL， 120xxrpm離心 2min，收集菌體。 在 PDA 平板中央接入直徑為 6mm 的病原真菌菌餅，分別于距離病原真菌菌餅中央 處的四個點放置 4 個已滅菌的牛津杯，取 150μL拮抗菌株無細胞培養(yǎng)濾液于牛津杯中，以向牛津杯中加入 150μL 無菌水為空白對照，每個處理重復(fù) 3 次， 28℃ 恒溫培養(yǎng) 5d，定期查看病原真菌的生長情況，測量并記錄抑菌帶寬度。將發(fā)酵液在 4℃ 條件下， 120xxrpm離心 15min，收集上清液。 采用平板對峙培養(yǎng)法 (Sanket, 20xx)考察待測細菌菌株對病原真菌的抑制能力。 菌懸液制備 取活化好的待測細菌菌株、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌斜面，分別用 10mL無菌生理鹽水沖洗各菌株斜面，渦旋振蕩混勻后，平板菌落計數(shù)，然后用無菌生理鹽水將各菌體濃度均調(diào)整為 106CFU/mL，即得到待測細菌及指示菌菌懸液。 分別將黃曲霉、黑曲霉、擴展青霉、禾谷鐮刀菌、細極鏈格孢接種于 PDA平板上， 28℃ 恒溫培養(yǎng) 5d 后，用無菌打孔器在培養(yǎng)好的各真菌平板上打孔，得到直徑 6mm的病原真菌菌餅。 河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 8 第二章 廣譜拮抗菌株的篩選及其鑒定 材料 樣品 表 21 試驗所用樣品及來源 樣品代號 樣品 樣品來源 LM05 土壤 騰沖地區(qū)輪馬熱泉 LM07 土壤 騰沖地區(qū)輪馬熱泉 BH03 土壤 騰沖地區(qū)北海溫泉 BH04 土壤 騰沖地區(qū)北海溫泉 LM08 土壤 騰沖地區(qū)輪馬熱泉 LM19 土壤 騰沖地區(qū)輪馬熱泉 LM21 土壤 騰沖地區(qū)輪馬熱泉 LM23 土壤 騰沖地區(qū)輪馬熱泉 LM25 土壤 騰沖地區(qū)輪馬熱泉 RH07 土壤 騰沖地區(qū)大滾鍋石側(cè)水溝 RH08 土壤 騰沖地區(qū)大滾鍋石側(cè)水溝 DT02 土壤 騰沖地區(qū)大塘熱泉 DTO3 土壤 騰沖地區(qū)大塘熱泉 DT05 土壤 騰沖地區(qū)大塘熱泉 DTO6 土壤 騰沖地區(qū)大塘熱泉 DT21 土壤 騰沖地區(qū)大塘熱泉 RST19 土壤 騰沖地區(qū)熱水塘大池 SQ03 土壤 騰沖地區(qū)石墻熱泉 DZ05 土壤 騰沖地區(qū)膽扎溫泉 DZ06 土壤 騰沖地區(qū)膽扎溫泉 DT19 土壤 騰沖地區(qū)大塘熱泉 DT18 土壤 騰沖地區(qū)大塘熱泉 廣譜高效微生物防腐劑產(chǎn)生菌的篩選及應(yīng)用 9 試劑 表 22 試劑 試劑名稱 規(guī)格 生產(chǎn)廠家 牛肉浸膏 BR 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司 氯化鈉 AR 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司 酵母膏 AR 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司 瓊脂粉 BR 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 葡萄糖 AR 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 乳糖 AR 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 蛋白胨 BR 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司 雙氧水 AR 汕頭市西隴化工廠有限公司 磷酸二氫鈉 AR 天津市化學(xué)試劑三廠 硝酸鉀 AR 天津市瑞金化學(xué)品有限公司 乙酸 AR 開封市芳晶化學(xué)試劑有限公司 鹽酸 AR 洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司 三氯化鐵 AR 天津市化學(xué)試劑工廠 碘 AR 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 甲基紅 AR 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 4氨基苯磺酸鈉 AR 國藥集團化學(xué)試劑有限公司 結(jié)晶紫 AR 天津市化學(xué)試劑三廠 次氯酸鈉 AR 天津市光復(fù)精細化工研究所 番紅花紅 T AR 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C， Bacillomycin L、 D、 F、 LC 和 Mycosubtilin 等 (Yao et al, 20xx)，如圖 12 所示?？莶菅挎邨U菌 Surfactin 由于肽鏈中