【正文】 分離內(nèi)肽酶產(chǎn)生菌，除了用酪蛋白作底物平板產(chǎn)生透明圈進(jìn)行鑒別外，還可以用吲羥乙酸酯為底物加到分離培養(yǎng)基中，產(chǎn)生蛋白酶的菌落由于水解吲羥乙酸酯為3羥基吲哚，后者能氧化生成藍(lán)色產(chǎn)物，根據(jù)呈色圈便可選出平板上產(chǎn)蛋白酶的菌落。最常使用的方法是把惡秦染料中的維多利亞藍(lán)和脂類底物混合，制成維多利亞藍(lán)乳脂瓊脂培養(yǎng)基平板，起始培養(yǎng)基調(diào)為中性，當(dāng)土壤樣品的懸濁液分離在平板上，具有脂解能力的 菌落產(chǎn)生的脂肪酶水解油脂底物，使pH值由中性下降到微酸性或酸性，陽性解脂反應(yīng)能顯示粉紅到藍(lán)色的變化。在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍(lán)，它是一種酸堿指示劑，～。在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板成混狀，將樣品懸浮液涂抹到平板上進(jìn)行培養(yǎng)，由于產(chǎn)生菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以輕易地鑒別出來。該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時(shí)采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會(huì)在含有底物的選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見的透明圈。分離培養(yǎng)基是根據(jù)目的微生物特殊的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)來設(shè)計(jì)的。第二種方法，取風(fēng)干粉末狀的土樣少許（幾十毫克）直接灑在選擇性分離培養(yǎng)基平板上或混入培養(yǎng)基中制成平板，置適溫培養(yǎng)一定時(shí)間，長出菌落。（二）劃線分離法 用接種環(huán)取部分樣品或菌體，在事先已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基平板上劃線，當(dāng)單個(gè)菌落長出后，將菌落移入斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后備用。 下面對(duì)這幾種分離純化方法分別加以介紹。前兩種方法由于操作簡便有效，工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較多。富集后的培養(yǎng)液中仍然有多種微生物混雜在一起，即使占了優(yōu)勢(shì)的一類微生物中，也并非純種。但是如果按通常分離方法，在培養(yǎng)基平板上能出現(xiàn)足夠數(shù)量的目的微生物，則不必進(jìn)行富集培養(yǎng)，直接分離、純化即可。另外據(jù)報(bào)道，重鉻酸鉀對(duì)土壤真菌、細(xì)菌有明顯的抑制作用，也可用于選擇分離放線菌。可先將土樣加熱到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h，殺死不產(chǎn)芽孢的菌種后再進(jìn)行分離。因嚴(yán)格厭氧菌不僅可省略通氣、攪拌裝置，還可節(jié)省能耗。因此，富集培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到被分離微生物的要求范圍不僅有利于自身生長，也可排除一部分不需要的菌類。連續(xù)富集培養(yǎng)的方法雖耗時(shí)較長，有時(shí)甚至需要6～7個(gè)月，但效果較好。移種的時(shí)間既可根據(jù)底物的降解情況，也可通過微生物的生長情況確定。在配制時(shí)要特別注意酵母浸膏加量，過多會(huì)刺激菌絲生長，而不利于孢子的產(chǎn)生。又如要分離耐高滲酵母菌，由于該類菌在一般樣品中含量很少，富集培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件必須嚴(yán)密設(shè)計(jì)。富集培養(yǎng)基的選擇性只是相對(duì)的，它只是微生物分離中的一個(gè)步驟。如果環(huán)境中含有較多某種物質(zhì)，則其中能分解利用該物質(zhì)的微生物也較多。含微生物樣品的富集培養(yǎng) 富集（enrichment）培養(yǎng)是在目的微生物含量較少時(shí)，根據(jù)微生物的生理特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長條件，使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長繁殖，數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣勢(shì)種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢(shì)種，以利分離到所需要的菌株。有人從溫泉和海底火山口分離出了極端嗜熱菌。由于大部分堿湖伴有高鹽，許多嗜堿菌同時(shí)也是嗜鹽菌。主要分布于寒冷的環(huán)境中，如南北兩極地區(qū)、冰窟、高山、深海和土壤等低溫環(huán)境中。2．極端環(huán)境條件的影響 微生物一般在中溫、中性pH條件下生長。如得克薩斯州中南部的一個(gè)巖洞中存在著大量嗜堿性的，能進(jìn)行氨氧化和產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物，其原因是這里生活這2000萬只蝙蝠，它們每晚吃釣5萬lb（磅）昆蟲，其排泄物造成了洞內(nèi)0m深的豐富營養(yǎng)層，這種特殊的環(huán)境對(duì)該種微生物起了選擇和富集的作用。筆者從鱈魚腸道中分離到一株pj20細(xì)菌，在15℃%。 海洋對(duì)于微生物來說是一個(gè)特殊的局部環(huán)境，盡管許多微生物也是經(jīng)河水、污水、雨水或塵埃等途徑而來，但由于海洋獨(dú)特的高鹽度、高壓力、低溫及光照條件，使海洋微生物具備特殊的生理活性，相應(yīng)也產(chǎn)生了一些不同于陸地來源的特殊產(chǎn)物。三、特殊環(huán)境下采樣1．局部環(huán)境條件的影響 值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和環(huán)境條件綜合因素的影響之外，還要受局部環(huán)境條件的影響。如篩選高溫酶產(chǎn)生菌時(shí)，通常到溫度較高的南方，或溫泉、火山爆發(fā)處及北方的堆肥中采集樣品；分離低溫酶產(chǎn)生菌時(shí)可到寒冷的地方，如南北極地區(qū)、冰窖、深海中采樣；分離耐壓菌則通常到海洋底部采樣。以石油等碳?xì)浠衔餅樘荚吹挠吞镂⑸?，也可以利用一些糖類為碳源。?%乙烯氯化物的空氣通過該菌培養(yǎng)可除去93%的毒性。在篩選果膠酶產(chǎn)生菌時(shí)，由于柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有較多的果膠，因此，從上述樣品的腐爛部分及果園土中采樣較好。二．根據(jù)微生物生理特點(diǎn)采樣 每種微生物對(duì)碳\氮源的需求不一樣,分布也有差異。給塑料袋編號(hào)并記錄地點(diǎn)、土壤質(zhì)地、植被名稱、時(shí)間及其他環(huán)境條件。但就南方來說，春季往往雨水多，土壤含水量高，通氣不良，即使有微生物所需的溫度、濕度，也不利于其生長繁殖。許多工業(yè)微生物菌種，如抗生素產(chǎn)生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多從南方土壤中篩選出來。如番茄地或腐爛番茄堆積處有較多維生素C生產(chǎn)菌。 土壤酸堿度會(huì)影響微生物種類的分布。因此，采土樣最好的土層是5～25cm。因此，在分離菌株前要根據(jù)分離篩選的目的，到相應(yīng)的環(huán)境和地區(qū)去采集樣品。一、從土壤中采樣 土壤由于具備了微生物所需的營養(yǎng)、空氣和水分，是微生物最集中的地方。 第一節(jié)（2）由自然界采集樣品，如土壤、水、動(dòng)植物體等，從中進(jìn)行分離篩選。工業(yè)微生物產(chǎn)生菌的分離篩選菌株分離（separation）就是將一個(gè)混雜著各種微生物的樣品通過分離技術(shù)區(qū)分開，并按照實(shí)際要求和菌株的特性采取迅速、準(zhǔn)確、有效的方法對(duì)他們進(jìn)行分離、篩選，進(jìn)而得到所需微生物的過程。 在實(shí)驗(yàn)工作中，為使篩選達(dá)到事半功倍的效果，總的說來可從以下幾個(gè)途徑進(jìn)行收集和篩選：（1）向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取有關(guān)的菌株，從中篩選所需菌株。 菌株的分離和篩選一般可分為采樣、富集、分離、產(chǎn)物鑒別幾個(gè)步驟。但總體來講土壤樣品的含菌量最多。但各種微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也隨著地理?xiàng)l件、養(yǎng)分、水分、土質(zhì)、季節(jié)而有很大的變化。 從土層的縱剖面看，1～5cm的表層土由于陽光照射，蒸發(fā)量大，水分少，且有紫外線的殺菌作用，因而微生物數(shù)量比5～25cm土層少；25cm以下土層則因土質(zhì)緊密，空氣量不足，養(yǎng)分與水分缺乏，含菌量也逐步減少。但總的說來酵母菌分布土層最淺，約5～10cm，霉菌和好氧芽孢桿菌也分布在淺土層。由于植物根部的分泌物有所不同，因此，植被對(duì)微生物分布也有一定的影響。3．地理?xiàng)l件 南方土壤比北方土壤中的微生物數(shù)量和種類都要多，特別是熱帶和亞熱帶地區(qū)的土壤。到了春天隨著氣溫的升高，微生物生長旺盛，數(shù)量逐漸增加。北方土壤干燥，可在10～30cm處取樣。到一處將取好的土樣混勻，取3～4撒到試管斜面上，這樣可避免菌株因不能及時(shí)分離而死亡。若要篩選以糖質(zhì)為原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜餞、甜果及含糖濃度高的植物汁液中采樣。Hartman等人曾從乙烯氯化物的工廠附近分離到一株以乙烯氯化物為碳源和能源的分枝桿菌。 此外，不少微生物對(duì)碳源的利用是不完全專一的，如以油脂為碳源的某些脂肪酶產(chǎn)生菌同樣也可以分解淀粉或其他糖類物質(zhì)獲得能源而生長。 在篩選一些具有特殊性質(zhì)的微生物時(shí)，需根據(jù)該微生物獨(dú)特的生理特性到相應(yīng)的地點(diǎn)采樣。如有人曾在花蜜中分離到一株能耐30%高糖的耐高滲透壓的酵母菌。氧氣充足的土層中按理只適合于好氧菌生長，實(shí)際上也有一些嫌氣菌生活，原因是好氣菌生長繁殖消耗了土層中大量氧氣，為嫌氣菌創(chuàng)造了局部生長的有利環(huán)境，故一般土壤中也能分離到嫌氣菌。日本發(fā)現(xiàn)深海魚類腸道內(nèi)的嗜壓古細(xì)菌，80%以上的菌株可以生產(chǎn)EPA 和DHA，最高產(chǎn)量可達(dá)36%和24%。 具有特殊性質(zhì)的微生物通常分布在一些特殊的環(huán)境中。美國從用硝酸處理過的花生殼中分離到一株節(jié)桿菌，該菌以木質(zhì)素為唯一碳源，它對(duì)處理過的花生殼的消化率可達(dá)到63