【正文】 重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實(shí)驗(yàn)人員和向外界擴(kuò)散。其目的是保證實(shí)驗(yàn)的安全和推動(dòng)重組 DNA 的研究。 1974 年，提出了 DNA 重組實(shí)驗(yàn)具有潛在生物危險(xiǎn)性的問(wèn)題。這些菌能間接地危害人體健康，使治療藥物失去效用，污染環(huán)境等。 一、安全問(wèn)題 關(guān)于基因工程的社會(huì)問(wèn)題，必須提到它的潛在危險(xiǎn)性。 第二節(jié) 工程菌的培養(yǎng) 就生產(chǎn)流程而言，從發(fā)酵到分離、純化目標(biāo)產(chǎn)物，工程菌和常規(guī)微生物并無(wú)太多的差異。 四、工程菌的應(yīng)用 1，基因藥物 例如，紅細(xì)胞生成素、胰島素、干優(yōu)素、乙肝疫苗、生長(zhǎng)激素和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子等。 4，代謝控制容易進(jìn)行。 2，菌株能利用常用的碳源，并可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。根據(jù)選擇性標(biāo)記，從菌落中篩選出目的基因的重組 (工程 )菌。 5，將目的基因連接到設(shè)計(jì)好的質(zhì)粒載體，形成了重組 DNA 分子。這些信使中包含了該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的合成信息。 2，找出產(chǎn)該產(chǎn)物的細(xì)胞。例如我們用一種經(jīng)過(guò)改造的抗四環(huán)素質(zhì)粒 PSC100 作載體，將一種基因移入自身無(wú)抗性的大腸桿菌時(shí)，如果基因移入后大腸桿菌不能被四環(huán)素殺死，就說(shuō)明轉(zhuǎn)入獲得成功了。運(yùn)載體將目的基因運(yùn)到受體細(xì)胞是基因工程的最后一步，目的基因的導(dǎo)入過(guò)程是肉眼看不到的。理想的運(yùn)載體是質(zhì)粒，因?yàn)橘|(zhì)粒能自由進(jìn)出細(xì)菌細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)用 “分子剪刀 ”把它切開(kāi)，再給它安裝上一段外來(lái)的 DNA 片段后，它依然如故地能自我復(fù)制。只要在用同一種 “分子剪刀 ”剪切的兩種 DNA 碎片中加上 “分子針線 ”，就會(huì)把兩種DNA 片段重新連接起來(lái)。 1974 年以后，科學(xué)界正式肯定了這一發(fā)現(xiàn)，并把這種酶叫作 DNA 連接酶。 DNA 的分子鏈被切開(kāi)后，還得縫接起來(lái)以完成基因的拼接。自 70 年代以來(lái)，人們已經(jīng)分離提取了 400 多種 “分子剪刀 ”。人們把這種限制性內(nèi)切酶稱(chēng)為 “分子剪刀 ”。內(nèi)森斯博士和漢密爾 1968 年，沃納 DNA 分子很小，其直徑只有 20 埃，約相當(dāng)于五百萬(wàn)分之一厘米，在它們身上進(jìn)行 “手術(shù) ”是非常困難的，因此基因工程實(shí)際上是一種 “ 超級(jí)顯微工程 ” ，對(duì) DNA 的切割、縫合與轉(zhuǎn)運(yùn)，必須有特殊的工具。除 DNA重組技術(shù)外，基因工程還應(yīng)包括基因的表達(dá)技術(shù)，基因的突變技術(shù)，基因的導(dǎo)入技術(shù)等。 基因工程的核心技術(shù)是 DNA 的重組技術(shù)。但是從許多研究中發(fā)現(xiàn)，工程 菌在保存過(guò)程中及發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，因而工程菌不穩(wěn)定性的解決已日益受到重視并成為基因工程這一高技術(shù)成就轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力的關(guān)鍵之一。它不僅為我們提供了一種極為有效的菌種改良技術(shù)和手段，也為攻克醫(yī)學(xué)上的疑難雜癥 —— 癌、遺傳病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；為農(nóng)業(yè)的第三次革命提供了基礎(chǔ)；為深入探索生命的奧秘提供了有力的手段。電鏡照片顯示固定化細(xì)胞間存在緊密接觸，似乎有可能由于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移而提高了工程菌的穩(wěn)定性，通過(guò)將 和 細(xì)胞共固定化并培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)：沒(méi)有細(xì)胞能在含有萘啶酮酸和氨芐青霉素的平板上生長(zhǎng)，從而否定了固定化通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的可能。因此固定化生長(zhǎng)細(xì)胞可被看成是一個(gè)免受 P細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)的細(xì)胞 庫(kù)。例如將具有 pTG201 和不具 pTG201 的 混合，游離培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn) P＋ 細(xì)胞很快消失，而共固定化后的培養(yǎng)則 P＋ 細(xì)胞和 P細(xì)胞能維持恒定比例達(dá) 80 代以上。而固定化顆粒的物理性能，使得兩種細(xì)胞間的競(jìng)爭(zhēng)被極大地降低。 4，處理重金屬?gòu)U水 由于微生物經(jīng)固定化后，其穩(wěn)定性增加，抗生物毒性物質(zhì)的能力也大大增強(qiáng)，因此可以被廣泛地用于各種有機(jī)廢水中重金屬離子的去除。固定化細(xì)胞能利用這些物質(zhì)生長(zhǎng)并使之完全降解。固定化細(xì)胞對(duì)廢水中酚類(lèi)等有毒物質(zhì)的降解能力遠(yuǎn)大于游離細(xì)胞。固定化細(xì)胞技術(shù)在處理氨氮廢水中的主要優(yōu)勢(shì)在于可通過(guò)高濃度的固定細(xì)胞，提高硝化和反硝化速度，同時(shí)還可以使在反硝化過(guò)程低溫時(shí)易失活的反硝化菌保持較高活性。硝化菌、脫氮菌的增殖速度慢，要想提高去除率，必須要較長(zhǎng)的停留時(shí)間和較高的細(xì)胞濃度。這一過(guò)程可以連續(xù)化操作。在 200 升的反應(yīng)器中， L色氨酸的產(chǎn)率可達(dá)到 110g/L。而采用固定化細(xì)胞技術(shù)，由于生長(zhǎng)被抑制，因而不會(huì)影響氧的傳遞。 二、有機(jī)酸的生產(chǎn) 檸檬酸是有機(jī)酸中的主要品種，檸檬酸一般是以黑曲 霉為菌種來(lái)生產(chǎn)?？股氐陌l(fā)酵為非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型，因此生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物合成階段所需的營(yíng)養(yǎng)條件不同。 細(xì)胞再循環(huán)系統(tǒng)（ Cell recycle systems ） In a fermenter with cell recycle the cells are separated from the effluent and then recycled back to the fermenter。 第四節(jié) 固定化細(xì)胞反應(yīng)器 一、固定化細(xì)胞反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn) A higher cell concentration in the immobilised bioreactor prevents the microbial population from pletely washing out. 固定化細(xì)胞反應(yīng)器具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1，在固定化細(xì)胞反應(yīng)器中采 用高稀釋率有以下優(yōu)點(diǎn)： 2，生產(chǎn)強(qiáng)度、轉(zhuǎn)化率高； 3，與衡化器相比，固定化細(xì)胞反應(yīng)器具有更好的穩(wěn)定性； 4，節(jié)省投資和能耗。 2，溫度 類(lèi)似與 pH，細(xì)胞固 定化方法不同，也有可能導(dǎo)致最適溫度產(chǎn)生不同的變化。如，用聚丙烯酰胺包埋的大腸桿菌中的天門(mén)冬氨酸酶和產(chǎn)氨短桿菌中的延胡索酸酶的最適 pH 向酸性范圍偏移。但目前大多數(shù)制備成顆粒狀珠體。但這類(lèi)方法只適用于小分子底物。 交聯(lián)法：可得到高細(xì)胞濃度，但機(jī)械強(qiáng)度低，無(wú)法再生，不適于實(shí)際應(yīng)用。 共價(jià)法：操作穩(wěn)定性高。 五、固定化方法的比較 吸附法：條件溫和、方法簡(jiǎn)便、載體可再生。包埋法可以分為： 1，微膠囊法：利用半透性聚合物薄膜將細(xì)胞包裹起來(lái)，形成微型膠囊； 2，凝膠包埋法：是在無(wú)菌條件下，將生物細(xì)胞和膠溶液混合在一起，然后再經(jīng)過(guò)相應(yīng)的造粒處理，形成直徑為 14mm的膠粒。 由于交聯(lián)試劑的毒性，這一方法具有一定的局限性。 三、交聯(lián)法 利用雙功能或多功能試劑與細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）反應(yīng)，從而使細(xì)胞固定。塑料 3，影響吸附固定 化的因素 （ 1） Z電位 （ 2）細(xì)胞的性質(zhì)和細(xì)胞壁的組成 （ 3）載體的性質(zhì) （ 4） pH 二、共價(jià)結(jié)合法 利用細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）與活化的無(wú)機(jī)或有機(jī)載體反應(yīng)，形成共價(jià)鍵將細(xì)胞固定。該法操作簡(jiǎn)單，固定化過(guò)程對(duì)細(xì)胞活性影響小。 一、吸附法 1，原理 利用載體和細(xì)胞表面所帶電荷的靜電引力（ van der Walls forces），使細(xì)胞吸附于載體上。 第二節(jié) 細(xì)胞固定化的方法 細(xì)胞固定化方法有： Adsorption（吸附）； covalent bonding（共價(jià)結(jié)合）；Cross linking（交聯(lián)）； Entrapment（包埋）、 Encapsulation（微膠囊） 。 （ 2）活細(xì)胞：包括增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、饑餓細(xì)胞。 2，按細(xì)胞的生理狀態(tài)不同分為兩大類(lèi)： （ 1）死細(xì)胞：包括完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器。 2，與固定化酶相比 與固定化酶相比， 固定化細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)： （ 1）免去了破碎細(xì)胞提取酶的手續(xù) （ 2）酶在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性較高，完整細(xì)胞固定化后酶活性損失少 （ 3）固定化細(xì)胞制備的成本比固定化酶低 （ 4）無(wú)需輔酶再生 三、固定化細(xì)胞的缺點(diǎn) 雖然 固定化細(xì)胞具有上述許多優(yōu)點(diǎn)，但也有不足之處，具體表現(xiàn)在： 1，僅能利用胞內(nèi) 酶； 2，細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用； 3，載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性； 4，可能有副反應(yīng)。 二、固定化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn) 1，與游離細(xì)胞相比 與游離細(xì)胞發(fā)酵相比，固定化細(xì)胞發(fā)酵具有以下優(yōu)點(diǎn)： （ 1）固定化細(xì)胞可以將微生物發(fā)酵改為連續(xù)酶反應(yīng) （ 2）可以獲得更高的細(xì)胞濃度； （ 3）細(xì)胞可以重復(fù)使 用； （ 4）在高稀釋率時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生洗脫現(xiàn)象； （ 5）單位容積的產(chǎn)率高； （ 6）提高遺傳穩(wěn)定性； （ 7）細(xì)胞不會(huì)受到剪切效應(yīng)的影響。第十四章 固定化細(xì)胞發(fā)酵 Fermentation with immobilized cells 第一節(jié) 概述 一、定義 固定化細(xì)胞就是被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞，既細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具備能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。是在酶固定化基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。 （ 8）發(fā)酵液中菌體含量少，有利與產(chǎn)品的分離純化。 四、固定化細(xì)胞的分類(lèi)