【正文】 （ 2）有一些暫時性的融合子，時間一久就會分離成親本類型。 5：融合子的選擇 ? 主要通過遺傳性標記進行篩選。 ? 再生率通常為百分之幾到百分之十幾。 電融合儀 4：細胞壁的再生 ? 二個原生質(zhì)體融合之后，必須涂布于再生培養(yǎng)基上進行細胞壁的再生。 ? 誘導(dǎo)液：融合液＋20％－ 45％ PEG ? 稀釋液：含葡萄糖，NaOH，甘氨酸等。 ? 最終濃度要求： PEG3040% MgCl220mmol CaCl250mmol PH= ? 為了提高融合頻度，同時可采用電誘導(dǎo)融合法、紫外線照射融合法。所使用的 PEG分子量要求為 100012023。 3：二種原生質(zhì)體進行融合 ? （ 1）病毒介導(dǎo)法 ? （ 2）聚乙二醇 (PEG)法 ? （ 3） 電融合法 （ 1）病毒介導(dǎo)法 原理 利用病毒表面蛋白同時與兩個細胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)細胞與細胞的融合。 （ 5）霉菌 ? 霉菌屬于絲狀真菌，其原生質(zhì)體的制備方法各不相同。 ? 可以采用含 — %甘氨酸的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，效果較好。 ? （ 1）采用 EDTA+溶菌酶、或者 EDTA+溶菌酶 +甘氨酸進行消化 ? （ 2）也可采用含有青霉素的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，也能獲得無細胞壁的原生質(zhì)體。 ? 黃色短桿菌 溶菌酶消化 + /ml的青霉素 G、振蕩培養(yǎng) 。 ? 不同的微生物，原生質(zhì)體的制備方法也各不相同。原生質(zhì)體從細胞壁中逸出。 4：細胞壁的再生 5：融合子的選擇 原生質(zhì)體培養(yǎng)和細胞融合技術(shù)圖示 1：選出二個帶有標記的親株 ? 親株要求性能穩(wěn)定。 2：二個親株分別制備原生質(zhì)體。 分泌蛋白表達的原理圖示 B：分泌蛋白表達常用的信號肽 ? 堿性磷酸酶信號肽（ phoA） ? 膜外周質(zhì)蛋白信號肽（ OmpA） ? 霍亂弧菌毒素 B亞單位信號肽（ CTXB） 關(guān)于基因表達的總結(jié) ? 總而言之，一種功能蛋白質(zhì)的合成，取決于“該基因的轉(zhuǎn)錄 +mRNA的有效轉(zhuǎn)譯+蛋白質(zhì)的加工”等各個環(huán)節(jié)。 （ 3）分泌蛋白表達方式 ? A：分泌蛋白表達的原理 ? B：分泌蛋白表達常用的信號肽 A：分泌蛋白表達的原理 ? 如果把真核 DNA結(jié)合到一個細菌信號肽基因上，其結(jié)果，細菌信號肽就能引導(dǎo)真核蛋白質(zhì)通過細胞膜，使蛋白質(zhì)分泌到細胞膜有外面，這樣一來，對于蛋白質(zhì)的分離和提純都相當有利。 ? 要求 2： ATG和真核結(jié)構(gòu)基因序列之間必須加接人工接頭，以保證 ATG之后的真核基因不發(fā)生通讀框架的改變。產(chǎn)物喪失生物活性，需要經(jīng)過復(fù)性，即使蛋白質(zhì)重新折疊。產(chǎn)物容易回收，包涵體的密度大于細胞碎片，破碎細胞后離心即可獲得外源蛋白。當外源蛋白大量表達時，這些非天然的蛋白質(zhì)往往容易形成包涵體。 ? 非融合蛋白表達方式也稱為 包涵體型外源蛋白的表達。 D：融合蛋白的具體表達方式 ? 融合基因 融合蛋白 ? 基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子 — 原核 SD序列 — 原核結(jié)構(gòu)基因片段 — 真核結(jié)構(gòu)基因序列 — 原核終止密碼子” 關(guān)鍵： ?受體蛋白與外源蛋白的閱讀框要對齊 ?兩個蛋白的結(jié)合位點的設(shè)計很重要，應(yīng)便于下一步切除受體蛋白的操作。 C：融合蛋白表達方式的改進措施 ? （ 1）在體外，采用特異的蛋白酶（凝血因子 X、膠原酶、腸激肽酶）對融合蛋白進行降解。 B：融合蛋白表達方式的優(yōu)缺點 ? 融合蛋白表達方式的優(yōu)點 基因操作簡便、蛋白質(zhì)在細菌體內(nèi)較為穩(wěn)定，不會被細菌酶所降解，容易實現(xiàn)高效表達。 表達細則 ? （ 1）使用強啟動子 ? （ 2）調(diào)節(jié)適當?shù)谋磉_溫度 ? （ 3）使用表達誘導(dǎo)劑 表達方式 ? （ 1）融合蛋白表達方式 ? （ 2）非融合蛋白表達方式 ? （ 3）分泌蛋白表達方式 （ 1）融合蛋白表達方式 ? A：融合蛋白的定義 ? B：融合蛋白表達方式的優(yōu)缺點 ? C：融合蛋白表達方式的改進措施 ? D：融合蛋白的具體表達方式 A：融合蛋白的定義 ? 融合蛋白的氨基酸端由大腸桿菌原核基因編碼、而另一端（羧基端）則由真核基因編碼。 ? （ 5）真核基因所產(chǎn)生的 mRNA必須相當穩(wěn)定，并且能夠被大腸桿菌的核糖體所轉(zhuǎn)譯。 ? （ 3）真核基因重組到大腸桿菌之后，真核基因 DNA不能被細菌基因的內(nèi)含子分割成二段，因為在大腸桿菌原核細胞中缺乏蛋白質(zhì)拼接系統(tǒng)。 真核基因的起始密碼子為 ATG， ATG不能被大腸桿菌 RNA聚合酶識別。 （五）：重組 DNA的表達 真核基因在大腸桿菌中的表達 ? 表達條件 ? 表達細則 ? 表達方式 表達條件（ 1） ? （ 1）重組基因中必須具有一個能夠被大腸桿菌 RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）識別的啟動子。 ? ↓ mRNA與已經(jīng)固定的 DNA進行雜交，形成 RNADNA復(fù)合體 ↓ 提取 RNADNA復(fù)合體，加熱處理，使其釋放出 mRNA ↓ 將 mRNA進行轉(zhuǎn)譯： （ 1）在無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中轉(zhuǎn)譯 兔網(wǎng)狀細胞溶解產(chǎn)物、小麥胚抽提物（商品名 BRL、 NEN） （ 2）在非洲爪蛙的卵母細胞中轉(zhuǎn)譯 ↓ 轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物進行蛋白質(zhì)屬性鑒定：采用方法： （ 1）免疫沉淀法 （ 2） SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法。 （ 6）蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯表達法 ? cDNA克隆中帶有特異性的 mRNA互補的順序，提取細胞 mRNA。 差異展示 PCR法（ DDPCR) 基本原理：將具有兩組細胞在某一條件下可表達的mRNA 群體通過逆轉(zhuǎn)錄方法變成相應(yīng)的 cDNA 群體，以此為模板，利用一對特殊引物，在一定條件下進行PCR擴增，得到與 mRNA相對應(yīng)的 DNA。只要聚合酶的功能正常 +有足夠的 三磷酸脫氧核苷酸 dATP、 dTTP 、 dGTP、 dCTP。 ↓ 如此反復(fù)加溫 +冷卻。 ↓ 第二次混合加熱，使得 DNA雙鏈分開。 ↓ 通過放射自顯影檢測出來 ↓ 陽性菌落中就含有重組的目的基因。 ? 生物素結(jié)合的二抗 與凝集素緊密結(jié)合 ， 酶的顯色反應(yīng)進行檢測 。 ? 熒光素異硫氰酸鹽標記的二抗 紫外燈 。 ? 辣根過氧化物酶 將 3氨基 9乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?4氯萘酚氧化成藍色產(chǎn)物 。 ↓ 洗去多余的 P標記的 RNA探針 ↓ 通過放射自顯影，找出與探針雜交的菌落 ↓ 陽性菌落中就含有重組的目的基因。 （ 3）原位雜交法 ? A：原位雜交法的定義 ? B： 原位雜交法的步驟 A：原位雜交法的定義 ? 使用帶 P標記的特異性 RNA、DNA，作為探針，就可以在原位鑒定含有這個基因的菌落或者噬菌斑，這種方法稱為原位雜交法。 當用這種熒光抗體處理細胞克隆株時，含有這一基因的克隆株，由于其蛋白質(zhì)能與抗體進行特異性結(jié)合而顯出熒光。 （四）：重組體的選擇和鑒定 （ 1）遺傳學(xué)方法 （ 2） 免疫學(xué)方法 （ 3）原位雜交法 （ 4）原位放射免疫法 （ 5）聚合酶連鎖反應(yīng)（ PCR法）選擇克隆株 （ 6）蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯表達法 （ 1）遺傳學(xué)方法 ? 類似于細菌抗生素抗性培養(yǎng)試驗 如果所需要的基因為抗藥性基因，就可以從受體細胞是否從對藥物敏感的不抗藥狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榭顾帬顟B(tài)，來判斷它是否獲得了抗藥性基因。 ↓ 從選擇出的菌株中回收重組 DNA B ：鳥槍法的優(yōu)缺點 ? 鳥槍法的優(yōu)點 采用鳥槍射擊去命中“預(yù)定目標”的原理，該方法能夠繞過直接分離目的基因的難關(guān)。 ↓ 轉(zhuǎn)化到受體菌中進行基因增殖。 （ 4）鳥槍法 ? A：鳥槍法的具體步驟 ? B：鳥槍法的優(yōu)缺點 A：鳥槍法的具體步驟 ? 先將供體細胞的染色體 DNA，經(jīng)過酶處理、或者物理學(xué)方法切割成基因水平的很多片段。 （ 3）互補 DNA分離法（ cDNA法） 第一步、 雙鏈 cDNA的制作 第二步、線性質(zhì)粒 DNA的制作 第三步、雙鏈 cDNA和線性質(zhì)粒 DNA鏈的拼接 第一步、 雙鏈 cDNA的制作 ? mRNA ↓ 逆轉(zhuǎn)錄酶 cDNA第一鏈互補鏈 ↓ 堿水解除去 mRNA模板 cDNA第一鏈（ 3`端帶有發(fā)夾環(huán)） ↓ 逆轉(zhuǎn)錄酶、或者用大腸桿菌聚合酶 I 從 cDNA第一鏈 3`端的發(fā)夾環(huán)開始合成 cDNA第二鏈 ↓SI 核酸酶降解發(fā)夾環(huán) 得到雙鏈 cDNA ↓ 雙鏈 cDNA（同聚物接尾法） 加上人工接頭 CCCCCC mRNA的分離 OligodT纖維素柱 OligodT磁珠法 mRNA mRNAcDNA Hybrid nick 逆轉(zhuǎn)錄酶 RNase H DNA聚合酶 T4連接酶 T4 DNA聚合酶處理形成平頭末端 Nick Translation cDNA的合成方法之 1 逆轉(zhuǎn)錄酶 末端轉(zhuǎn)移酶 dCTP RNAaseH D