【正文】 都是重組型。如果用堿性磷酸酯酶、或者用小牛腸道磷酸脂酶處理已經(jīng)經(jīng)過內(nèi)切的質(zhì)粒 DNA，就可以除去 5`磷酸基。 ? 而外源性 DNA由于帶有 5`磷酸基，仍然能夠結(jié)合到質(zhì)粒 DNA上，形成帶有二個(gè) OH缺口的開環(huán)分子（內(nèi)環(huán)一端 HOOH缺口、外環(huán)另一端HOOH缺口）。 （二）： DNA分子的重組 ? 粘性末端連接法 ? 同聚物接尾法 ? 人工合成接頭法 ? 人工接頭 + 平齊末端的 DNA鏈 （三）：基因的分離 ? （ 1）物理學(xué)密度梯度離心法 ? （ 2）凝膠電泳分離技術(shù) ? （ 3）互補(bǔ) DNA分離法（ cDNA法） ? （ 4）鳥槍法 （ 1）物理學(xué)密度梯度離心法 ? 不同 DNA片段，其密度不同，借此進(jìn)行密度梯度離心，實(shí)現(xiàn)分離。實(shí)現(xiàn)分離。 ↓ 進(jìn)行其它類型的 DNA二次重組。 ↓ 將每一片段和載體進(jìn)行重組。 ↓ 采用適當(dāng)?shù)暮Y選方法，從眾多的菌落中選出帶有目的基因的菌株。 ? 鳥槍法的難點(diǎn) 必須有一種有效的目的基因檢測(cè)方法，常用 mRNA作為探針，進(jìn)行原位雜交法檢驗(yàn)。 （ 2）免疫學(xué)方法 當(dāng)受體細(xì)胞獲得了某一基因之后，常常在細(xì)胞中出現(xiàn)由該基因編碼的蛋白質(zhì)，因此可以通過免疫的方法制備出針對(duì)這種蛋白質(zhì)的抗體，然后將這種抗體用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。這樣就可以把含有這種目的基因的克隆株篩選出來(lái)。 B： 原位雜交法的步驟 ? 將細(xì)菌菌落轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上， ↓ 用堿處理濾膜上的菌落，使質(zhì)粒 DNA變性， ↓ 待 DNA固定在濾膜上之后，洗去細(xì)胞碎屑， ↓ 用 P標(biāo)記的 RNA探針、或者 DNA探針進(jìn)行連接酶反應(yīng)。 原位雜交的圖示 （ 4）原位放射免疫法 ? A：原位放射免疫法的原理 ? B：原位放射免疫法的顯色試劑 ? C：原位放射免疫法的步驟 A：原位放射免疫法的原理 ? 原位雜交法 + 蛋白質(zhì)抗原抗體反應(yīng) 原位放射免疫法 B：原位放射免疫法的顯色試劑 ? 堿性磷酸酶 將無(wú)色的底物 5溴 4氯吲哚磷酸鹽 （ BCIP） 轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物 。 ? I125標(biāo)記的二抗 放射自顯影檢測(cè) 。 ? 金標(biāo)記的二抗 金顆粒包裹 ， 可以表現(xiàn)紅色 。 C：原位放射免疫法的步驟 ? 對(duì)于已知的基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)） ↓ 提純，注射到家兔體內(nèi)，制備免疫血清（抗體） ↓ 提取特異性抗體 IgG ↓ IgG通過碘化作用，標(biāo)記上 I ↓ 將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂布于培養(yǎng)皿中 ↓ 堿處理，使細(xì)菌裂解，菌落釋放出抗原， ↓ 加入經(jīng)過標(biāo)記的特異性抗體 IgG，抗原、抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。 （ 5）聚合酶連鎖反應(yīng)（ PCR法）選擇克隆株 ? 樣品 DNA+復(fù)制所需要的引物核苷酸短鏈（大約 2個(gè)核苷酸左右）+DNA聚合酶 +大量的三磷酸脫氧核苷酸 dATP、 dTTP 、 dGTP、 dCTP ↓ 混合加熱，使得 DNA雙鏈分開（這一過程稱為 DNA變性） ↓ 冷卻，（ DNA復(fù)性）， 引物核苷酸短鏈分別附在 2條單鏈 DNA的兩端，聚合酶就會(huì)從引物開始，沿著 DNA單鏈進(jìn)行復(fù)制式的 DNA合成。 ↓ 第二次冷卻，合成第二批次的 DNA。可重復(fù)無(wú)數(shù)次。就可以大量復(fù)制出與樣品 DNA一樣的 DNA分子。通過變性聚丙烯酰胺電泳，檢測(cè)差異條帶。 用堿處理待篩選的菌落使細(xì)胞變性， DNA固定在濾膜上。 ↓ 最終定位出相應(yīng)的重組工程菌 DNA。 大腸桿菌原核基因的起始密碼子為 AUG。 ? （ 2）重組 DNA轉(zhuǎn)錄出的 mRNA，必須有一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)， 大腸桿菌自身 DNA轉(zhuǎn)錄出的 mRNA，在其核糖體結(jié)合位點(diǎn)上有一個(gè)轉(zhuǎn)譯起始密碼子（ AUG） + SD序列， SD序列與大腸桿菌的 16SrRNA的 3`端堿基實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。 表達(dá)條件（ 2） ? （ 4）真核基因必須位于大腸桿菌啟動(dòng)子下游的有效控制區(qū)域內(nèi)，以便使得 RNA聚合酶在識(shí)別啟動(dòng)子之后，立即開始蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯。 ? （ 6）真核基因所表達(dá)出的異種蛋白質(zhì)，不會(huì)被細(xì)胞蛋白酶所降解。 ? 最終表達(dá)出來(lái)的蛋白質(zhì) =1條原核多肽 +1條真核多肽，因此稱為融合蛋白。 ? 融合蛋白表達(dá)方式的缺點(diǎn) 由于融合蛋白中含有原核多肽，帶有細(xì)菌蛋白質(zhì)的抗原性，不能直接用作人體注射劑。 ? （ 2）用化學(xué)物質(zhì)（ CNBr）進(jìn)行蛋白質(zhì)水解，形成原核多肽 +真核蛋白質(zhì)分子，從而獲得具有生物活性的天然真核蛋白質(zhì)分子。 融合表達(dá)載體的構(gòu)建 常用的受體蛋白（原核細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)） 受體蛋白的切除方法 ?化學(xué)斷裂法：溴化氰（ CNBr） MetAA ?酶促斷裂法：凝血因子 Xa，有蛋白酶活性，識(shí)別序列 :Ile－ Glu－ Gly－ Arg－ AA （ 2）非融合蛋白表達(dá)方式 ? A：非融合蛋白表達(dá)方式的定義 ? B：非融合蛋白表達(dá)方式的優(yōu)缺點(diǎn) ? C：非融合蛋白的具體表達(dá)方式 A：非融合蛋白表達(dá)方式的定義 ? 非融合蛋白表達(dá)方式是指蛋白質(zhì)的表達(dá)是以真核 mRNA的起始密碼子開始，其結(jié)果使得蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸端不帶任何細(xì)菌性的多肽序列。大腸桿菌能積累某些特殊生物大分子，使之致密的聚集在細(xì)胞內(nèi)，形成一種水不溶性的結(jié)構(gòu)。 B：非融合蛋白表達(dá)方式的優(yōu)缺點(diǎn) ? 非融合蛋白表達(dá)方式的優(yōu)點(diǎn) 能夠產(chǎn)生天然的真核蛋白質(zhì)。 ? 非融合蛋白表達(dá)方式的缺點(diǎn) 蛋白質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)容易被細(xì)菌蛋白酶所破壞。 C：非融合蛋白的具體表達(dá)方式 ? 非融合蛋白表達(dá)方式可分為 2種： （ a）非融合基因 — 非融合蛋白 （ b）融合基因 — 非融合蛋白 （ a）非融合基因 — 非融合蛋白 ? 基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子 — 原核 SD序列 —ATG— 真核結(jié)構(gòu)基因序列 — 原核終止密碼子” ? 要求 1： SD序列和 ATG之間的距離要合適，相差 23個(gè)堿基，其表達(dá)效率就大受影響。 （ b）融合基因 — 非融合蛋白 ? 基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子 — 原核 SD序列 — 原核 ATG— TGATG（真核基因起始結(jié)構(gòu)） — 真核結(jié)構(gòu)基因序列 — 原核終止密碼子” ? 這一方式能夠提高表達(dá)效率。 ? 基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子 — 原核 SD序列 — 原核結(jié)構(gòu)基因片段 — 細(xì)菌信號(hào)肽基因 — 真核結(jié)構(gòu)基因序列 — 原核終止密碼子”。在這些過程中，只要有某一個(gè)細(xì)節(jié)不正確，該基因就不能實(shí)現(xiàn)有效的表達(dá)！ ? 目前，真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平還不夠理想?。? 第四節(jié)：原生質(zhì)體融合技術(shù) 原生質(zhì)體融合技術(shù)共分為 5步，步驟如下： 1：選出二個(gè)帶有標(biāo)記的親株。 3：二種原生質(zhì)體進(jìn)行融合。 ? 親株應(yīng)該帶有標(biāo)記 ? 常用的標(biāo)記物有： （ 1）營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記 （ 2）抗藥性標(biāo)記 （ 3）溫度敏感型標(biāo)記 （ 4）呼吸缺陷型標(biāo)記 （ 5）色素標(biāo)記 2：二個(gè)親株分別制備原生質(zhì)體 ? 二親本分別用酶處理，使得細(xì)胞壁被消化。 ? 為了防止原生質(zhì)體的破裂，應(yīng)將原生質(zhì)體釋放到高滲緩沖液、或者高滲培養(yǎng)液中。 ? （ 1）革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 ? （ 2）革蘭氏陰性細(xì)菌 ? （ 3）鏈霉菌 ? （ 4）酵母菌 ? （ 5）霉菌 （ 1）革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 ? 枯草桿菌、芽孢桿菌 可用單一的溶菌酶消化。 （ 2）革蘭氏陰性細(xì)菌 ? 革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁除了肽聚糖外，還含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核聚糖等成份，單一的溶菌酶不能完全消化。 （ 3）鏈霉菌 ? 鏈霉菌是由不同菌齡有菌絲所構(gòu)成，其原生質(zhì)體制備更加復(fù)雜。 （ 4）酵母菌 ? 將酵母菌株接種于 %巰基乙醇+，培養(yǎng)后的菌體易于制備原生質(zhì)體。 ? 必要時(shí)請(qǐng)參閱相關(guān)專著。 如：仙臺(tái)病毒 （ 2）聚乙二醇 (PEG)法 ? 二種原生質(zhì)體等量混合之后，加入聚乙二醇（ PEG）進(jìn)行融合。再加入 Ca、 Mg。 聚乙二醇法的步驟圖示 ? 融合液：含山梨醇或甘露醇， Ca2＋ ，K＋ 。 （ 3） 電融合法 ? 原理： 在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面電荷發(fā)生改變，從而使原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而連接閉合形成融合體。 ? 再生培養(yǎng)基采用高滲培養(yǎng)基。 ? 再生后的菌落，可在斜面培養(yǎng)基上作劃線培養(yǎng)。 ? 融合子的性能各不相同， （ 1）真正的融合子，其特性較為穩(wěn)定。 親本細(xì)胞 同核體 異核體 多核體 異胞質(zhì)體 核質(zhì)體 （ 1）融合細(xì)胞的類型 融合細(xì)胞的篩選機(jī)制 外觀選擇 熒光標(biāo)記選擇 融合細(xì)胞的互補(bǔ)選擇技術(shù) 遺傳互補(bǔ)篩選法 抗性互補(bǔ)篩選法 營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選法 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAIT