【正文】 ↓ 通過放射自顯影檢測出來 ↓ 陽性菌落中就含有重組的目的基因。 ? 熒光素異硫氰酸鹽標記的二抗 紫外燈 。 ↓ 洗去多余的 P標記的 RNA探針 ↓ 通過放射自顯影，找出與探針雜交的菌落 ↓ 陽性菌落中就含有重組的目的基因。 當用這種熒光抗體處理細胞克隆株時，含有這一基因的克隆株，由于其蛋白質能與抗體進行特異性結合而顯出熒光。 ↓ 從選擇出的菌株中回收重組 DNA B ：鳥槍法的優(yōu)缺點 ? 鳥槍法的優(yōu)點 采用鳥槍射擊去命中“預定目標”的原理，該方法能夠繞過直接分離目的基因的難關。 （ 4）鳥槍法 ? A：鳥槍法的具體步驟 ? B：鳥槍法的優(yōu)缺點 A：鳥槍法的具體步驟 ? 先將供體細胞的染色體 DNA，經(jīng)過酶處理、或者物理學方法切割成基因水平的很多片段。 （ 2）凝膠電泳分離技術 ? 通過凝膠電泳，分段收集大小不同的 DNA片段， ? 然后用快速轉化法來檢驗其目的蛋白質，進行基因定位。因此，在復性時就能阻止質粒 DNA的環(huán)化。 ? 質粒本身由于二個不同粘性末端的接頭不能互補，無法進行環(huán)化。 B、定向克隆法 ? 將載體質粒 pBR322同時用二種限制酶 BamHI、 HindIII進行消化內切，形成二個不同粘性末端的接頭。 ? 在存活的轉化菌株中，同時含有：（ 1）重組質粒、（ 2）不含重組 DNA的自體環(huán)化質粒。由于外源基因的插入，導致 LacZ失去活性，菌落顯白色，而未插入重組子的菌落顯藍色。 （ b） DNA變性處理法 ? 采用熱變性、或者用溫和的堿（ PH=）變性，可以斷開染色體 DNA上的氫鍵、而質粒上的共價鍵則不能斷開，當溫度逐漸冷卻進行復性操作時，染色體 DNA成線性分子，而質粒 DNA則呈閉環(huán)型，可以實現(xiàn)分離。 RrnB核糖體終止基因（終止子） PvuI帶有青霉素抗性基因 Ampr。 ? 質粒上帶有幾種限制性內切酶的切斷點位。 ? 基因工程載體的共同特點是： （ 1）能在大腸桿菌中自主復制，接上外源 DNA后還能夠自我復制。 ? 3：發(fā)現(xiàn)了運載外源性目的基因的載體。 ? 人們已經(jīng)成功地將人或者動物的某些基因，如胰島素基因、生長激素基因、胸腺激素基因、干擾素基因、乙型肝炎病毒抗原基因、口蹄疫病毒抗原基因導入到大腸桿菌之中。 4：聚焦電泳 密度梯度電泳，等電點聚焦電泳，親和電泳。是指針對脂溶性的生物大分子，按照其分子大小進行分離的方法。 以聚乙烯醇為骨架的 Toyopearl。 以瓊脂糖 +聚丙烯酰胺為骨架的 Ultrogel。 （ 4）凝膠分子篩層析 ? A：凝膠層析的骨架介質 ? B：凝膠層析介質的主要產(chǎn)品的品牌 ? C：根據(jù)不同洗脫液的凝膠層析分類 A：凝膠層析的骨架介質 （ 1）天然多糖類介質 （ 2）纖維素類介質 （ 3）葡聚糖類介質 （ 4）瓊脂糖類介質 （ 5）合成大分子類介質 B：凝膠層析介質的主要產(chǎn)品的品牌 ? 以葡聚糖類介質為骨架的 Sephadex。 （ 1）陽離子交換劑經(jīng)過堿洗 → 水洗 → 酸洗 → 水洗的處理序。 （ 4）以聚丙烯酰胺作為骨架的離子交換樹脂 （ 5）以瓊脂糖凝膠作為骨架的離子交換樹脂 如 CMSepharoseCL6B， DEAE SepharoseCL6B。 ? 離子交換劑所吸附的帶電基團有： （ 1）酚基、羥基、羧基、磺酸基 形成陽離子交換劑， （ 2）氨基、芳香氨基 形成陰離子交換劑。 ? 全自動 BioProcess標準層析系統(tǒng)，其流速可達 420升 /小時。 2：有機高分子基質分離介質 ? 常用的有機高分子基質分離介質有： （ 1）苯乙烯 — 二乙烯苯共聚物 屬于交聯(lián)體性質，常用的有 MonoQ、 MonoS介質。羥基磷灰石（ HAP）用于生物制劑分離純化的例子有：細胞蛋白、病毒和亞細胞顆粒、細菌蛋白、精蛋白、重組蛋白、核蛋白、水解酶、異構酶、轉移酶、氨基酸、多肽、多糖。常常選用孔徑在 25nm以上的球形硅膠介質。 ? 根據(jù)層析所使用的介質不同，可分為 1：無機基質分離介質 2：有機高分子基質分離介質。 四：分離純化技術 （一）：膜分離技術 （二）：層析技術 （三）：電泳技術 （一）：膜分離技術 1：滲透法 2：反滲透法 3：超濾技術 4：電滲析法 5：多孔陶瓷膜分離法 6：滲透汽化法 3：超濾技術 （ 1）微濾法，其濾膜的孔徑為 — ，可阻留分子量為 20100萬的物質，所需要的壓力在 ，適用于細菌、微粒的過濾， （ 2）超濾法，也稱為錯流過濾，其濾膜的孔徑為 —，可阻留分子量為 350萬的物質，所需要的壓力在 ，適用于大分子蛋白質與小分子有機物的分離， （ 3）納濾法，其膜孔徑為納米級細孔，能截流的最小分子為1nm，截留分子量為 200— 1000。所以稱之為雙水相。 （ 2）化學反應萃取 ? （尚在試驗之中） ? 05SFT150超臨界萃取反應儀 （ 3）其它萃取技術 ? 液膜萃取 ? 反膠團萃取 ? 電場強化萃取 ? 超臨界萃取 ? 凝膠萃取 所有這樣技術尚在實驗室階段，還沒有應用于工業(yè)生產(chǎn)。 5：表面活性劑增溶溶解法 采用洗滌劑破壞細胞壁，使內含物釋放出來。 4：超聲波破碎法 利用超聲波的空穴作用來破碎細胞。通過基因重組技術，克隆牛的多巴胺生成細胞到大鼠體內，以期望能夠大量生產(chǎn)多巴胺。 （ 3）生產(chǎn)成本低。 ? 基因疫苗的特征： （ 1）基因疫苗既具有預防作用、又具有治療作用。 （ 2）將這種質粒作為疫苗注射到動物體內。 四：基因重組疫苗 基因疫苗的生產(chǎn)方法 基因疫苗的種類和特征 基因疫苗的優(yōu)缺點 1990年 9月 14日 ， 美國國立衛(wèi)生研究院 （National Institutes of Health, NIH） 正式批準安德生 （ W. F. Anderson）領導的治療小組為一位因腺苷脫氨酶 （ADA） 基因缺陷而出現(xiàn) 嚴重綜合性免疫缺陷癥 （ SCID） 的４歲女孩作基因治療 。 植物生物反應器實例（ 3） ? 血管緊張肽轉化酶抑制劑（ ACEI）在煙草花葉病毒中轉基因 抗過敏反應 ? 流感病毒血凝素和艾滋病毒抗原（ HIV1gp120）在煙草花葉病毒中轉基因 ? 瘧疾抗原在煙草花葉病毒中轉基因 ? 口蹄疫病毒抗原和象鼻病毒抗原（ HRV14）在豇豆花葉病毒中轉基因 ? 水貂腸炎病毒抗原（ MEVVP2）在豇豆花葉病毒中轉基因 ? 犬細小病毒抗原（ CPVCPVP2）在李痘病毒中轉基因。 三：動物細胞基因在植物中的表達 ? 動物細胞基因在植物中的表達就是植物生物反應器。 哺乳動物乳腺反應器工程優(yōu)點 （ 1）通過乳汁獲得藥物，能夠獲得較高的產(chǎn)量，同時也容易提純。 ? 優(yōu)點 能夠持續(xù)不斷地獲得轉基因藥物。 Palmiter等人于1982年將大鼠的生長激素基因導入小鼠受精卵的雄原核中。例如：人凝血因子 1X就是通過動物細胞工程生產(chǎn)的。 基因工程有以下分類： 1：細菌基因工程 2：哺乳動物細胞工程 3：哺乳動物體內生物反應器工程 4：哺乳動物乳腺反應器工程 1：細菌基因工程 ? 把目的基因導入到細菌中，通過目的基因所表達的蛋白質，來生產(chǎn)藥物。 （ 5）血管緊張素轉化酶抑制劑可治療高血壓。 一：酶蛋白抑制劑 ? 不同的酶抑制劑可用于治療許多不同的疾病。 ? 基因工程藥物又涉及到酶蛋白抑制劑、基因重組疫苗、單克隆抗體、基因治療藥物 。 （ 3） 3羥基 3甲基 戊二酰輔酶 A膽固醇乙酰轉移（ 4）酶抑制劑治療高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化。 二：基因工程藥物 ? 基因工程藥物著眼于整個基因組，其方法是讓目的基因在一個體外系統(tǒng)的細胞中表達，再經(jīng)過分離純化，來生產(chǎn)藥物。 2：哺乳動物細胞工程 ? 通過培養(yǎng)動物細胞，將目的基因導入到動物細胞內，用來生產(chǎn)動物或人所需要的蛋白質藥物。 （ 2）生產(chǎn)成本較高 轉基因動物 1974年， Jaenish和 Mintz應用顯微注射法，在世界上首次成功地獲得了 AV40 DNA轉基因小鼠。 如美國 Genzyme公司培育出的 tpA轉基因山羊，每知羊奶中 tpA的含量最高可達 100克。 ? 英國羅斯林研究所的轉基因羊，其乳汁中含有 a1抗胰蛋白酶，可用來治療囊性纖維化肺病、肺氣腫。 （ 4）對于牛、羊這些大量分泌乳汁的動物來說，動物本身就相當于一座大型的藥物工廠。 植物生物反應器實例（ 2） ? 水蛭素（ Hirudin）在植物中轉基因 凝血酶抑制因子 ? 表皮生長因子（ EGF）在植物中轉基因 刺激上皮細胞分裂 ? 促紅細胞生成素（ EPO）在植物中轉基因 調節(jié)紅細胞水平 ? 紅鱒生長激素（ Growth hormone）在植物中轉基因 刺激生長 ? 人血清白蛋白（ Human serum albumin）在植物中轉基因 ? 人干擾素（ HIFNaD）在花椰菜花葉病毒中轉基因