【正文】 ↓ 通過放射自顯影檢測(cè)出來 ↓ 陽性菌落中就含有重組的目的基因。 ? 熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記的二抗 紫外燈 。 ↓ 洗去多余的 P標(biāo)記的 RNA探針 ↓ 通過放射自顯影，找出與探針雜交的菌落 ↓ 陽性菌落中就含有重組的目的基因。 當(dāng)用這種熒光抗體處理細(xì)胞克隆株時(shí)，含有這一基因的克隆株，由于其蛋白質(zhì)能與抗體進(jìn)行特異性結(jié)合而顯出熒光。 ↓ 從選擇出的菌株中回收重組 DNA B ：鳥槍法的優(yōu)缺點(diǎn) ? 鳥槍法的優(yōu)點(diǎn) 采用鳥槍射擊去命中“預(yù)定目標(biāo)”的原理，該方法能夠繞過直接分離目的基因的難關(guān)。 （ 4）鳥槍法 ? A：鳥槍法的具體步驟 ? B：鳥槍法的優(yōu)缺點(diǎn) A：鳥槍法的具體步驟 ? 先將供體細(xì)胞的染色體 DNA，經(jīng)過酶處理、或者物理學(xué)方法切割成基因水平的很多片段。 （ 2）凝膠電泳分離技術(shù) ? 通過凝膠電泳，分段收集大小不同的 DNA片段， ? 然后用快速轉(zhuǎn)化法來檢驗(yàn)其目的蛋白質(zhì)，進(jìn)行基因定位。因此，在復(fù)性時(shí)就能阻止質(zhì)粒 DNA的環(huán)化。 ? 質(zhì)粒本身由于二個(gè)不同粘性末端的接頭不能互補(bǔ)，無法進(jìn)行環(huán)化。 B、定向克隆法 ? 將載體質(zhì)粒 pBR322同時(shí)用二種限制酶 BamHI、 HindIII進(jìn)行消化內(nèi)切，形成二個(gè)不同粘性末端的接頭。 ? 在存活的轉(zhuǎn)化菌株中，同時(shí)含有：（ 1）重組質(zhì)粒、（ 2）不含重組 DNA的自體環(huán)化質(zhì)粒。由于外源基因的插入，導(dǎo)致 LacZ失去活性，菌落顯白色，而未插入重組子的菌落顯藍(lán)色。 （ b） DNA變性處理法 ? 采用熱變性、或者用溫和的堿（ PH=）變性，可以斷開染色體 DNA上的氫鍵、而質(zhì)粒上的共價(jià)鍵則不能斷開，當(dāng)溫度逐漸冷卻進(jìn)行復(fù)性操作時(shí)，染色體 DNA成線性分子，而質(zhì)粒 DNA則呈閉環(huán)型，可以實(shí)現(xiàn)分離。 RrnB核糖體終止基因（終止子） PvuI帶有青霉素抗性基因 Ampr。 ? 質(zhì)粒上帶有幾種限制性內(nèi)切酶的切斷點(diǎn)位。 ? 基因工程載體的共同特點(diǎn)是： （ 1）能在大腸桿菌中自主復(fù)制，接上外源 DNA后還能夠自我復(fù)制。 ? 3：發(fā)現(xiàn)了運(yùn)載外源性目的基因的載體。 ? 人們已經(jīng)成功地將人或者動(dòng)物的某些基因，如胰島素基因、生長(zhǎng)激素基因、胸腺激素基因、干擾素基因、乙型肝炎病毒抗原基因、口蹄疫病毒抗原基因?qū)氲酱竽c桿菌之中。 4：聚焦電泳 密度梯度電泳，等電點(diǎn)聚焦電泳，親和電泳。是指針對(duì)脂溶性的生物大分子，按照其分子大小進(jìn)行分離的方法。 以聚乙烯醇為骨架的 Toyopearl。 以瓊脂糖 +聚丙烯酰胺為骨架的 Ultrogel。 （ 4）凝膠分子篩層析 ? A：凝膠層析的骨架介質(zhì) ? B：凝膠層析介質(zhì)的主要產(chǎn)品的品牌 ? C：根據(jù)不同洗脫液的凝膠層析分類 A：凝膠層析的骨架介質(zhì) （ 1）天然多糖類介質(zhì) （ 2）纖維素類介質(zhì) （ 3）葡聚糖類介質(zhì) （ 4）瓊脂糖類介質(zhì) （ 5）合成大分子類介質(zhì) B：凝膠層析介質(zhì)的主要產(chǎn)品的品牌 ? 以葡聚糖類介質(zhì)為骨架的 Sephadex。 （ 1）陽離子交換劑經(jīng)過堿洗 → 水洗 → 酸洗 → 水洗的處理序。 （ 4）以聚丙烯酰胺作為骨架的離子交換樹脂 （ 5）以瓊脂糖凝膠作為骨架的離子交換樹脂 如 CMSepharoseCL6B， DEAE SepharoseCL6B。 ? 離子交換劑所吸附的帶電基團(tuán)有： （ 1）酚基、羥基、羧基、磺酸基 形成陽離子交換劑， （ 2）氨基、芳香氨基 形成陰離子交換劑。 ? 全自動(dòng) BioProcess標(biāo)準(zhǔn)層析系統(tǒng)，其流速可達(dá) 420升 /小時(shí)。 2：有機(jī)高分子基質(zhì)分離介質(zhì) ? 常用的有機(jī)高分子基質(zhì)分離介質(zhì)有： （ 1）苯乙烯 — 二乙烯苯共聚物 屬于交聯(lián)體性質(zhì)，常用的有 MonoQ、 MonoS介質(zhì)。羥基磷灰石（ HAP）用于生物制劑分離純化的例子有：細(xì)胞蛋白、病毒和亞細(xì)胞顆粒、細(xì)菌蛋白、精蛋白、重組蛋白、核蛋白、水解酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、氨基酸、多肽、多糖。常常選用孔徑在 25nm以上的球形硅膠介質(zhì)。 ? 根據(jù)層析所使用的介質(zhì)不同，可分為 1：無機(jī)基質(zhì)分離介質(zhì) 2：有機(jī)高分子基質(zhì)分離介質(zhì)。 四：分離純化技術(shù) （一）：膜分離技術(shù) （二）：層析技術(shù) （三）：電泳技術(shù) （一）：膜分離技術(shù) 1：滲透法 2：反滲透法 3：超濾技術(shù) 4：電滲析法 5：多孔陶瓷膜分離法 6：滲透汽化法 3：超濾技術(shù) （ 1）微濾法，其濾膜的孔徑為 — ，可阻留分子量為 20100萬的物質(zhì)，所需要的壓力在 ，適用于細(xì)菌、微粒的過濾， （ 2）超濾法，也稱為錯(cuò)流過濾，其濾膜的孔徑為 —，可阻留分子量為 350萬的物質(zhì)，所需要的壓力在 ，適用于大分子蛋白質(zhì)與小分子有機(jī)物的分離， （ 3）納濾法，其膜孔徑為納米級(jí)細(xì)孔，能截流的最小分子為1nm，截留分子量為 200— 1000。所以稱之為雙水相。 （ 2）化學(xué)反應(yīng)萃取 ? （尚在試驗(yàn)之中） ? 05SFT150超臨界萃取反應(yīng)儀 （ 3）其它萃取技術(shù) ? 液膜萃取 ? 反膠團(tuán)萃取 ? 電場(chǎng)強(qiáng)化萃取 ? 超臨界萃取 ? 凝膠萃取 所有這樣技術(shù)尚在實(shí)驗(yàn)室階段，還沒有應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。 5：表面活性劑增溶溶解法 采用洗滌劑破壞細(xì)胞壁，使內(nèi)含物釋放出來。 4：超聲波破碎法 利用超聲波的空穴作用來破碎細(xì)胞。通過基因重組技術(shù)，克隆牛的多巴胺生成細(xì)胞到大鼠體內(nèi)，以期望能夠大量生產(chǎn)多巴胺。 （ 3）生產(chǎn)成本低。 ? 基因疫苗的特征： （ 1）基因疫苗既具有預(yù)防作用、又具有治療作用。 （ 2）將這種質(zhì)粒作為疫苗注射到動(dòng)物體內(nèi)。 四：基因重組疫苗 基因疫苗的生產(chǎn)方法 基因疫苗的種類和特征 基因疫苗的優(yōu)缺點(diǎn) 1990年 9月 14日 ， 美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院 （National Institutes of Health, NIH） 正式批準(zhǔn)安德生 （ W. F. Anderson）領(lǐng)導(dǎo)的治療小組為一位因腺苷脫氨酶 （ADA） 基因缺陷而出現(xiàn) 嚴(yán)重綜合性免疫缺陷癥 （ SCID） 的４歲女孩作基因治療 。 植物生物反應(yīng)器實(shí)例（ 3） ? 血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ ACEI）在煙草花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 抗過敏反應(yīng) ? 流感病毒血凝素和艾滋病毒抗原（ HIV1gp120）在煙草花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 ? 瘧疾抗原在煙草花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 ? 口蹄疫病毒抗原和象鼻病毒抗原（ HRV14）在豇豆花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 ? 水貂腸炎病毒抗原（ MEVVP2）在豇豆花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 ? 犬細(xì)小病毒抗原（ CPVCPVP2）在李痘病毒中轉(zhuǎn)基因。 三：動(dòng)物細(xì)胞基因在植物中的表達(dá) ? 動(dòng)物細(xì)胞基因在植物中的表達(dá)就是植物生物反應(yīng)器。 哺乳動(dòng)物乳腺反應(yīng)器工程優(yōu)點(diǎn) （ 1）通過乳汁獲得藥物，能夠獲得較高的產(chǎn)量，同時(shí)也容易提純。 ? 優(yōu)點(diǎn) 能夠持續(xù)不斷地獲得轉(zhuǎn)基因藥物。 Palmiter等人于1982年將大鼠的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥小＠纾喝四蜃?1X就是通過動(dòng)物細(xì)胞工程生產(chǎn)的。 基因工程有以下分類： 1：細(xì)菌基因工程 2：哺乳動(dòng)物細(xì)胞工程 3：哺乳動(dòng)物體內(nèi)生物反應(yīng)器工程 4：哺乳動(dòng)物乳腺反應(yīng)器工程 1：細(xì)菌基因工程 ? 把目的基因?qū)氲郊?xì)菌中，通過目的基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)，來生產(chǎn)藥物。 （ 5）血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑可治療高血壓。 一：酶蛋白抑制劑 ? 不同的酶抑制劑可用于治療許多不同的疾病。 ? 基因工程藥物又涉及到酶蛋白抑制劑、基因重組疫苗、單克隆抗體、基因治療藥物 。 （ 3） 3羥基 3甲基 戊二酰輔酶 A膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移（ 4）酶抑制劑治療高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化。 二：基因工程藥物 ? 基因工程藥物著眼于整個(gè)基因組，其方法是讓目的基因在一個(gè)體外系統(tǒng)的細(xì)胞中表達(dá)，再經(jīng)過分離純化，來生產(chǎn)藥物。 2：哺乳動(dòng)物細(xì)胞工程 ? 通過培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，將目的基因?qū)氲絼?dòng)物細(xì)胞內(nèi)，用來生產(chǎn)動(dòng)物或人所需要的蛋白質(zhì)藥物。 （ 2）生產(chǎn)成本較高 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 1974年， Jaenish和 Mintz應(yīng)用顯微注射法，在世界上首次成功地獲得了 AV40 DNA轉(zhuǎn)基因小鼠。 如美國(guó) Genzyme公司培育出的 tpA轉(zhuǎn)基因山羊，每知羊奶中 tpA的含量最高可達(dá) 100克。 ? 英國(guó)羅斯林研究所的轉(zhuǎn)基因羊，其乳汁中含有 a1抗胰蛋白酶，可用來治療囊性纖維化肺病、肺氣腫。 （ 4）對(duì)于牛、羊這些大量分泌乳汁的動(dòng)物來說，動(dòng)物本身就相當(dāng)于一座大型的藥物工廠。 植物生物反應(yīng)器實(shí)例（ 2） ? 水蛭素（ Hirudin）在植物中轉(zhuǎn)基因 凝血酶抑制因子 ? 表皮生長(zhǎng)因子（ EGF）在植物中轉(zhuǎn)基因 刺激上皮細(xì)胞分裂 ? 促紅細(xì)胞生成素（ EPO）在植物中轉(zhuǎn)基因 調(diào)節(jié)紅細(xì)胞水平 ? 紅鱒生長(zhǎng)激素（ Growth hormone）在植物中轉(zhuǎn)基因 刺激生長(zhǎng) ? 人血清白蛋白（ Human serum albumin）在植物中轉(zhuǎn)基因 ? 人干擾素（ HIFNaD）在花椰菜花葉病毒中轉(zhuǎn)基因