【正文】 ? 再生后的菌落，可在斜面培養(yǎng)基上作劃線培養(yǎng)。再加入 Ca、 Mg。 （ 3）鏈霉菌 ? 鏈霉菌是由不同菌齡有菌絲所構(gòu)成，其原生質(zhì)體制備更加復(fù)雜。 ? 親株應(yīng)該帶有標(biāo)記 ? 常用的標(biāo)記物有： （ 1）營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記 （ 2）抗藥性標(biāo)記 （ 3）溫度敏感型標(biāo)記 （ 4）呼吸缺陷型標(biāo)記 （ 5）色素標(biāo)記 2：二個親株分別制備原生質(zhì)體 ? 二親本分別用酶處理，使得細胞壁被消化。 （ b）融合基因 — 非融合蛋白 ? 基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動子 — 原核 SD序列 — 原核 ATG— TGATG（真核基因起始結(jié)構(gòu)） — 真核結(jié)構(gòu)基因序列 — 原核終止密碼子” ? 這一方式能夠提高表達效率。大腸桿菌能積累某些特殊生物大分子，使之致密的聚集在細胞內(nèi)，形成一種水不溶性的結(jié)構(gòu)。 ? 最終表達出來的蛋白質(zhì) =1條原核多肽 +1條真核多肽，因此稱為融合蛋白。 大腸桿菌原核基因的起始密碼子為 AUG。就可以大量復(fù)制出與樣品 DNA一樣的 DNA分子。 C：原位放射免疫法的步驟 ? 對于已知的基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)） ↓ 提純，注射到家兔體內(nèi)，制備免疫血清（抗體） ↓ 提取特異性抗體 IgG ↓ IgG通過碘化作用，標(biāo)記上 I ↓ 將轉(zhuǎn)化的細菌涂布于培養(yǎng)皿中 ↓ 堿處理，使細菌裂解，菌落釋放出抗原， ↓ 加入經(jīng)過標(biāo)記的特異性抗體 IgG，抗原、抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。 B： 原位雜交法的步驟 ? 將細菌菌落轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上， ↓ 用堿處理濾膜上的菌落，使質(zhì)粒 DNA變性， ↓ 待 DNA固定在濾膜上之后，洗去細胞碎屑， ↓ 用 P標(biāo)記的 RNA探針、或者 DNA探針進行連接酶反應(yīng)。 ↓ 采用適當(dāng)?shù)暮Y選方法，從眾多的菌落中選出帶有目的基因的菌株。 （二）： DNA分子的重組 ? 粘性末端連接法 ? 同聚物接尾法 ? 人工合成接頭法 ? 人工接頭 + 平齊末端的 DNA鏈 （三）：基因的分離 ? （ 1）物理學(xué)密度梯度離心法 ? （ 2）凝膠電泳分離技術(shù) ? （ 3）互補 DNA分離法（ cDNA法） ? （ 4）鳥槍法 （ 1）物理學(xué)密度梯度離心法 ? 不同 DNA片段，其密度不同，借此進行密度梯度離心，實現(xiàn)分離。 ? 質(zhì)粒 +外源性 DNA由于粘性末端互補而形成連接。 ? 先將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到對青霉素敏感的大腸桿菌之中，并在培養(yǎng)基中加入青霉素，結(jié)果沒有被轉(zhuǎn)化的親本菌株死亡，存活的是轉(zhuǎn)化菌株。 （ a）差示離心沉淀法 ? 染色體 DNA多數(shù)是纏繞在細胞溶菌物的殘渣之中，密度較大，可以采用離心法除去。 ? 質(zhì)粒上帶有抗藥性選擇標(biāo)記。 ? 2：發(fā)現(xiàn)了 DNA連接酶 能夠?qū)嗔训?DNA修復(fù)，連接成完整的 DNA分子。 （三）：電泳技術(shù) ? 1：紙電泳 2：醋酸纖維膜電泳 3：凝膠電泳 淀粉凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳。 以聚苯乙烯為骨架的 BioBeadsSX。 （ 1）陽離子交換劑應(yīng)采用陰離子型緩沖液，如磷酸、乙酸、檸檬酸等等酸性緩沖液， （ 2）陰離子交換劑應(yīng)采用陽離子型緩沖液，如 Tris，胺鹽、吡啶等等。 （ 3）以葡聚糖凝膠作為骨架的離子交換樹脂 如 DEAESephadex， DEAESephadexA25。 ? 根據(jù)層析方法不同，又可分為： （ 1）紙層析 （ 2）薄層層析 （ 3）離子交換層析 （ 4）凝膠分子篩層析 （ 5）親和層析 （ 3）離子交換層析 ? 目前能夠在工業(yè)上加以應(yīng)用的離子交換層析設(shè)備有瑞典 Pharmacia公司生產(chǎn)的 BioPilot中試層析系統(tǒng)，其進樣量可達 10L。球形的羥基磷灰石產(chǎn)品有KOBECERAM、 HASI，片形的羥基磷灰石產(chǎn)品有中科院生化所生產(chǎn)的產(chǎn)品。 （二）：層析技術(shù) ? 層析技術(shù)用于目的產(chǎn)品的高效分離和純化。這二相之間互相不溶混，同時二相中的水溶液均超過 70%。此外，還有鏈霉菌酶、白細胞酶 C也可用于進行酶處理。 ? 為此人們開始研究動物的胎兒細胞。 基因疫苗的種類和特征 ? 目前，基因疫苗在治療流感病毒、乙型肝炎、結(jié)核病、瘧疾、狂犬病、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、艾滋病、干細胞淋巴瘤、腦炎病毒等等方面已經(jīng)進入研發(fā)階段。 缺點： 外源蛋白質(zhì)在植物中的表達水平還不高。 （ 4）對于牛、羊這些大量分泌乳汁的動物來說，動物本身就相當(dāng)于一座大型的藥物工廠。 如美國 Genzyme公司培育出的 tpA轉(zhuǎn)基因山羊，每知羊奶中 tpA的含量最高可達 100克。 2：哺乳動物細胞工程 ? 通過培養(yǎng)動物細胞，將目的基因?qū)氲絼游锛毎麅?nèi)，用來生產(chǎn)動物或人所需要的蛋白質(zhì)藥物。 （ 3） 3羥基 3甲基 戊二酰輔酶 A膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移（ 4）酶抑制劑治療高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化。 一：酶蛋白抑制劑 ? 不同的酶抑制劑可用于治療許多不同的疾病。 基因工程有以下分類： 1：細菌基因工程 2：哺乳動物細胞工程 3：哺乳動物體內(nèi)生物反應(yīng)器工程 4：哺乳動物乳腺反應(yīng)器工程 1：細菌基因工程 ? 把目的基因?qū)氲郊毦?，通過目的基因所表達的蛋白質(zhì)，來生產(chǎn)藥物。 Palmiter等人于1982年將大鼠的生長激素基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥小? 哺乳動物乳腺反應(yīng)器工程優(yōu)點 （ 1）通過乳汁獲得藥物，能夠獲得較高的產(chǎn)量，同時也容易提純。 植物生物反應(yīng)器實例（ 3） ? 血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ ACEI）在煙草花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 抗過敏反應(yīng) ? 流感病毒血凝素和艾滋病毒抗原（ HIV1gp120）在煙草花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 ? 瘧疾抗原在煙草花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 ? 口蹄疫病毒抗原和象鼻病毒抗原（ HRV14）在豇豆花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 ? 水貂腸炎病毒抗原（ MEVVP2）在豇豆花葉病毒中轉(zhuǎn)基因 ? 犬細小病毒抗原（ CPVCPVP2）在李痘病毒中轉(zhuǎn)基因。 （ 2）將這種質(zhì)粒作為疫苗注射到動物體內(nèi)。 （ 3）生產(chǎn)成本低。 4：超聲波破碎法 利用超聲波的空穴作用來破碎細胞。 （ 2）化學(xué)反應(yīng)萃取 ? （尚在試驗之中） ? 05SFT150超臨界萃取反應(yīng)儀 （ 3）其它萃取技術(shù) ? 液膜萃取 ? 反膠團萃取 ? 電場強化萃取 ? 超臨界萃取 ? 凝膠萃取 所有這樣技術(shù)尚在實驗室階段，還沒有應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。 四：分離純化技術(shù) （一）：膜分離技術(shù) （二）：層析技術(shù) （三）：電泳技術(shù) （一）：膜分離技術(shù) 1：滲透法 2：反滲透法 3：超濾技術(shù) 4：電滲析法 5：多孔陶瓷膜分離法 6：滲透汽化法 3：超濾技術(shù) （ 1）微濾法，其濾膜的孔徑為 — ，可阻留分子量為 20100萬的物質(zhì)，所需要的壓力在 ，適用于細菌、微粒的過濾， （ 2）超濾法，也稱為錯流過濾，其濾膜的孔徑為 —，可阻留分子量為 350萬的物質(zhì)，所需要的壓力在 ，適用于大分子蛋白質(zhì)與小分子有機物的分離， （ 3）納濾法，其膜孔徑為納米級細孔，能截流的最小分子為1nm，截留分子量為 200— 1000。常常選用孔徑在 25nm以上的球形硅膠介質(zhì)。 2：有機高分子基質(zhì)分離介質(zhì) ? 常用的有機高分子基質(zhì)分離介質(zhì)有： （ 1）苯乙烯 — 二乙烯苯共聚物 屬于交聯(lián)體性質(zhì)，常用的有 MonoQ、 MonoS介質(zhì)。 ? 離子交換劑所吸附的帶電基團有： （ 1）酚基、羥基、羧基、磺酸基 形成陽離子交換劑， （ 2）氨基、芳香氨基 形成陰離子交換劑。 （ 1）陽離子交換劑經(jīng)過堿洗 → 水洗 → 酸洗 → 水洗的處理序。 以瓊脂糖 +聚丙烯酰胺為骨架的 Ultrogel。是指針對脂溶性的生物大分子，按照其分子大小進行分離的方法。 ? 人們已經(jīng)成功地將人或者動物的某些基因，如胰島素基因、生長激素基因、胸腺激素基因、干擾素基因、乙型肝炎病毒抗原基因、口蹄疫病毒抗原基因?qū)氲酱竽c桿菌之中。 ? 基因工程載體的共同特點是： （ 1）能在大腸桿菌中自主復(fù)制，接上外源 DNA后還能夠自我復(fù)制。 RrnB核糖體終止基因（終止子） PvuI帶有青霉素抗性基因 Ampr。由于外源基因的插入，導(dǎo)致 LacZ失去活性，菌落顯白色，而未插入重組子的菌落顯藍色。 B、定向克隆法 ? 將載體質(zhì)粒 pBR322同時用二種限制酶 BamHI、 HindIII進行消化內(nèi)切，形成二個不同粘性末端的接頭。因此，在復(fù)性時就能阻止質(zhì)粒 DNA的環(huán)化。 （ 4）鳥槍法 ? A：鳥槍法的具體步驟 ? B：鳥槍法的優(yōu)缺點 A：鳥槍法的具體步驟 ? 先將供體細胞的染色體 DNA，經(jīng)過酶處理、或者物理學(xué)方法切割成基因水平的很多片段。 當(dāng)用這種熒光抗體處理細胞克隆株時，含有這一基因的克隆株，由于其蛋白質(zhì)能與抗體進行特異性結(jié)合而顯出熒光。 ? 熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記的二抗 紫外燈 。 ↓ 如此反復(fù)加溫 +冷卻。 ? ↓ mRNA與