【正文】 已經(jīng)固定的 DNA進(jìn)行雜交，形成 RNADNA復(fù)合體 ↓ 提取 RNADNA復(fù)合體，加熱處理，使其釋放出 mRNA ↓ 將 mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)譯： （ 1）在無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中轉(zhuǎn)譯 兔網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物、小麥胚抽提物（商品名 BRL、 NEN） （ 2）在非洲爪蛙的卵母細(xì)胞中轉(zhuǎn)譯 ↓ 轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)屬性鑒定：采用方法： （ 1）免疫沉淀法 （ 2） SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法。 ? （ 5）真核基因所產(chǎn)生的 mRNA必須相當(dāng)穩(wěn)定，并且能夠被大腸桿菌的核糖體所轉(zhuǎn)譯。 D：融合蛋白的具體表達(dá)方式 ? 融合基因 融合蛋白 ? 基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子 — 原核 SD序列 — 原核結(jié)構(gòu)基因片段 — 真核結(jié)構(gòu)基因序列 — 原核終止密碼子” 關(guān)鍵： ?受體蛋白與外源蛋白的閱讀框要對(duì)齊 ?兩個(gè)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)的設(shè)計(jì)很重要，應(yīng)便于下一步切除受體蛋白的操作。產(chǎn)物喪失生物活性，需要經(jīng)過復(fù)性，即使蛋白質(zhì)重新折疊。 2：二個(gè)親株分別制備原生質(zhì)體。 ? 黃色短桿菌 溶菌酶消化 + /ml的青霉素 G、振蕩培養(yǎng) 。 3：二種原生質(zhì)體進(jìn)行融合 ? （ 1）病毒介導(dǎo)法 ? （ 2）聚乙二醇 (PEG)法 ? （ 3） 電融合法 （ 1）病毒介導(dǎo)法 原理 利用病毒表面蛋白同時(shí)與兩個(gè)細(xì)胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的融合。 電融合儀 4：細(xì)胞壁的再生 ? 二個(gè)原生質(zhì)體融合之后，必須涂布于再生培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)胞壁的再生。 （ 2）有一些暫時(shí)性的融合子，時(shí)間一久就會(huì)分離成親本類型。 ? 誘導(dǎo)液：融合液＋20％－ 45％ PEG ? 稀釋液：含葡萄糖，NaOH，甘氨酸等。 （ 5）霉菌 ? 霉菌屬于絲狀真菌，其原生質(zhì)體的制備方法各不相同。 ? 不同的微生物，原生質(zhì)體的制備方法也各不相同。 分泌蛋白表達(dá)的原理圖示 B：分泌蛋白表達(dá)常用的信號(hào)肽 ? 堿性磷酸酶信號(hào)肽（ phoA） ? 膜外周質(zhì)蛋白信號(hào)肽（ OmpA） ? 霍亂弧菌毒素 B亞單位信號(hào)肽（ CTXB） 關(guān)于基因表達(dá)的總結(jié) ? 總而言之，一種功能蛋白質(zhì)的合成，取決于“該基因的轉(zhuǎn)錄 +mRNA的有效轉(zhuǎn)譯+蛋白質(zhì)的加工”等各個(gè)環(huán)節(jié)。產(chǎn)物容易回收，包涵體的密度大于細(xì)胞碎片，破碎細(xì)胞后離心即可獲得外源蛋白。 C：融合蛋白表達(dá)方式的改進(jìn)措施 ? （ 1）在體外，采用特異的蛋白酶（凝血因子 X、膠原酶、腸激肽酶）對(duì)融合蛋白進(jìn)行降解。 ? （ 3）真核基因重組到大腸桿菌之后，真核基因 DNA不能被細(xì)菌基因的內(nèi)含子分割成二段，因?yàn)樵诖竽c桿菌原核細(xì)胞中缺乏蛋白質(zhì)拼接系統(tǒng)。 （ 6）蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯表達(dá)法 ? cDNA克隆中帶有特異性的 mRNA互補(bǔ)的順序，提取細(xì)胞 mRNA。 ↓ 第二次混合加熱，使得 DNA雙鏈分開。 ? 辣根過氧化物酶 將 3氨基 9乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?4氯萘酚氧化成藍(lán)色產(chǎn)物 。 （四）：重組體的選擇和鑒定 （ 1）遺傳學(xué)方法 （ 2） 免疫學(xué)方法 （ 3）原位雜交法 （ 4）原位放射免疫法 （ 5）聚合酶連鎖反應(yīng)（ PCR法）選擇克隆株 （ 6）蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯表達(dá)法 （ 1）遺傳學(xué)方法 ? 類似于細(xì)菌抗生素抗性培養(yǎng)試驗(yàn) 如果所需要的基因?yàn)榭顾幮曰颍涂梢詮氖荏w細(xì)胞是否從對(duì)藥物敏感的不抗藥狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榭顾帬顟B(tài)，來(lái)判斷它是否獲得了抗藥性基因。 （ 3）互補(bǔ) DNA分離法（ cDNA法） 第一步、 雙鏈 cDNA的制作 第二步、線性質(zhì)粒 DNA的制作 第三步、雙鏈 cDNA和線性質(zhì)粒 DNA鏈的拼接 第一步、 雙鏈 cDNA的制作 ? mRNA ↓ 逆轉(zhuǎn)錄酶 cDNA第一鏈互補(bǔ)鏈 ↓ 堿水解除去 mRNA模板 cDNA第一鏈（ 3`端帶有發(fā)夾環(huán)） ↓ 逆轉(zhuǎn)錄酶、或者用大腸桿菌聚合酶 I 從 cDNA第一鏈 3`端的發(fā)夾環(huán)開始合成 cDNA第二鏈 ↓SI 核酸酶降解發(fā)夾環(huán) 得到雙鏈 cDNA ↓ 雙鏈 cDNA（同聚物接尾法） 加上人工接頭 CCCCCC mRNA的分離 OligodT纖維素柱 OligodT磁珠法 mRNA mRNAcDNA Hybrid nick 逆轉(zhuǎn)錄酶 RNase H DNA聚合酶 T4連接酶 T4 DNA聚合酶處理形成平頭末端 Nick Translation cDNA的合成方法之 1 逆轉(zhuǎn)錄酶 末端轉(zhuǎn)移酶 dCTP RNAaseH DNA聚合酶 cDNA的合成方法之 2 第二步、線性質(zhì)粒 DNA的制作 ? 質(zhì)粒 PstI（雙環(huán)型） ↓ 限制酶 線性質(zhì)粒 PstI— DNA鏈 ↓ 末端轉(zhuǎn)移酶 在線性質(zhì)粒 DNA鏈上加上 GGGGGGGG 第三步、雙鏈 cDNA和線性質(zhì)粒 DNA鏈的拼接 ? 雙鏈 cDNACCCCCC+線性質(zhì)粒 DNA上 GGGGGGG ↓ 退火、復(fù)性 cDNA— 重組質(zhì)粒 ↓ 轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中進(jìn)行大量擴(kuò)增 ↓ 特定的限制酶 形成特定位點(diǎn)內(nèi)切的雙鏈 cDNA，帶有粘性末端。 C、磷酸酯酶處理線型質(zhì)粒 DNA法 ? 在 DNA片段進(jìn)行連接時(shí)，二個(gè)核苷酸之間必須是：（ 1）一個(gè)帶有 5`磷酸基、（ 2）另一個(gè)帶有 3`羥基。 ? 將轉(zhuǎn)化菌株接種到改良后的四環(huán)素的培養(yǎng)基上。 （ 5）質(zhì)粒上的克隆方法 ? 先將質(zhì)粒 DNA用限制酶切開，在體外連接外源性 DNA，再將重組后的工程質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到細(xì)胞之中。 （ 2）常用的質(zhì)粒 ? pBV220 ? pBR322 ? pBG2 ? pMK16 ? pCYC184 ? 科斯質(zhì)粒 ? 噬菌體 λ ? 單鏈?zhǔn)删w M13 ? 酵母菌人工染色體 質(zhì)粒 PBR322 質(zhì)粒 PGBKT753 質(zhì)粒 PGEM3Z 質(zhì)粒 PUC18/19 科斯質(zhì)粒 l噬菌體 基因組 酵母菌人工染色體 （ 3）質(zhì)粒 pBV220的結(jié)構(gòu) ? ori復(fù)制起始點(diǎn) clts857抑制子基因，在 31℃ 時(shí)，其基因產(chǎn)物具有阻抑 PL的活性，當(dāng)溫度升高時(shí)，這種阻抑活性就喪失， PL就開始指導(dǎo)合成mRNA。 二：基因工程的步驟 （一）：工程載體的構(gòu)建 質(zhì)粒、科斯質(zhì)粒、噬菌體 λ 、單鏈?zhǔn)删w M13。 五：滅菌技術(shù) ? 1：干熱滅菌法 2：濕熱滅菌法 3：紫外線滅菌法 4：過濾滅菌法 5：化學(xué)滅菌法 六：干燥技術(shù) ? 1：烘干法 （ 1）噴霧干燥 （ 2）氣流干燥 （ 3）沸騰干燥 （ 4）鼓式干燥 ? 2：真空干燥法 ? 3：冷凍干燥法 第三節(jié)：基因工程技術(shù) ? 基因克隆操作，就是將外源性的 DNA分子結(jié)合到病毒、質(zhì)粒、或者其它載體系統(tǒng)這中。是指針對(duì)水溶性的生物大分子，按照其分子大小進(jìn)行分離的方法。 以瓊脂糖 +葡聚糖為骨架的 Superdex。方法是先將離子交換劑在水中充分浸泡 1— 2天，或者在沸水中煮沸 4— 5小時(shí)，然后用酸、堿反復(fù)處理。離子部分可以與溶液中的同性帶電基團(tuán)發(fā)生交換。 （ 2）親水凝膠層析， （ 3）大孔反相層析，是指在無(wú)機(jī)基質(zhì)分離介質(zhì)的表面涂有烷基介質(zhì)，其中長(zhǎng)鏈烷基介質(zhì)涂層適用于分離小肽，短鏈烷基介質(zhì)涂層適用于分離多肽及蛋白質(zhì)。 （ 1）可控孔徑的玻璃的化學(xué)成份中 SiO2，其表面可以通過涂層來(lái)進(jìn)行性能上的修飾。 ? 雙水相萃取的回收率一般在 8090%之間，其特點(diǎn)是清除細(xì)胞碎片的能力較強(qiáng)。 6：噬菌體作用法 7：電離輻射法 （三）新型技術(shù)和方法 1：激光破碎法 2：冷凍噴射法 3：高速相向流撞擊法 三：提取技術(shù) ? 1：鹽析法 2：有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法 3：等電點(diǎn)沉淀法 4：結(jié)晶和重結(jié)晶法 5：酶解法 6：萃取法（本章節(jié)重點(diǎn)講解） 7：透析法 8：吸附法 9：過濾技術(shù) 萃取法 ? （ 1）液 液萃取 ? （ 2）化學(xué)反應(yīng)萃取 ? （ 3）其它萃取技術(shù) ? （ 4）雙水相萃取 （ 1）液 液萃取 ? 是利用一種溶劑將生物產(chǎn)品從發(fā)酵液中提取出來(lái)的過程。 2：搗碎法 在韋林氏搗碎機(jī)中，細(xì)胞被徹底搗碎。 基因疫苗的優(yōu)缺點(diǎn) ? 基因疫苗的優(yōu)點(diǎn)： （ 1）基因疫苗的抗原結(jié)構(gòu)接近天然構(gòu)象。 到 1991年 5月 ， 經(jīng) 7次注射 ， 患兒體內(nèi) ADA水平達(dá)到正常人的 25％ ， 免疫功能逐漸恢復(fù) 。 植物生物反應(yīng)器實(shí)例 動(dòng)物細(xì)胞基因在植物中的表達(dá)中的優(yōu)缺點(diǎn) 植物生物反應(yīng)器實(shí)例（ 1） ? 乙肝病毒表面抗原（ HBsAg）在植物中轉(zhuǎn)基因 ? 大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸素菜 B亞基（ LTB）在植物中轉(zhuǎn)基因 ? 諾沃克病毒外殼蛋白（ Norwalk virus）在植物中轉(zhuǎn)基因 ? 蓋氏 13單克隆抗體（ Guys` 13 mAb）在植物中轉(zhuǎn)基因 預(yù)防齲齒 ? 谷氨酸脫羧酶（ GAD）在植物中轉(zhuǎn)基因 預(yù)防糖尿病 ? 粒細(xì)