【正文】 。 作業(yè)： 動(dòng)、植物細(xì)胞與微生物細(xì)胞相比有哪些培養(yǎng)特征。 ⑧抗 HBsAg單抗的分離純化： 將固定化抗大員 K輕鏈的 Sepharose 4B親和吸附劑 裝柱 (直徑 4cmX20cm)。 ⑦抗 HBsAg單克隆抗體的生產(chǎn)： 抗 HBsAg的單克隆抗體可采用人工生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，也可采用動(dòng)物體作為生物反應(yīng)器進(jìn)行生產(chǎn)，后者又可通過誘發(fā)實(shí)體瘤及腹水瘤進(jìn)行生產(chǎn)，本文敘述腹水瘤生產(chǎn)技術(shù)，其過程如下： 向健康的 Lou／ c大鼠腹腔注射 1ml降植烷 (Pristane)，飼養(yǎng) 1— 9周后，向大鼠腹腔接種 5x106個(gè)雜交瘤細(xì)胞， 飼養(yǎng) 9～ 11天后即可明顯產(chǎn)生腹水，待腹水量達(dá)到最大限度而大鼠又瀕于死亡之前時(shí)，處死動(dòng)物，用毛細(xì)管抽取腹水，一般可得 50ml左右。 當(dāng)新的 24孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)，即進(jìn)行消化分散轉(zhuǎn)移至小方瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)將種質(zhì)進(jìn)行保存。 在生長(zhǎng)良好的情況下，第 1～ 3行難有單克隆，第 4— 6行偶有單克隆，第 7— 8行多為單克?。? 培養(yǎng)至 9～ 10天后有部分孔中培養(yǎng)液上清液變 淡黃色 ，可能已有抗體產(chǎn)生。 經(jīng)檢測(cè)確定為產(chǎn)生抗 HBsAg單抗的陽(yáng)性孔細(xì)胞需進(jìn)行克隆和再克隆，井經(jīng)全面鑒定與分析，最后才能獲得產(chǎn)生抗HBsAg單抗的雜交瘤克隆系。培養(yǎng) 10天后改換含 HT的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)兩周后改用常規(guī) DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。 ⑤細(xì)胞融合： 取 107個(gè) IR983 F細(xì)胞與 108個(gè)免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞于50mi離心管中，混勻，在 4度下， 1500r／ min離心 8— 10min，用巴斯德吸管小心吸去上清液，輕彈管底，使沉淀的細(xì)胞松動(dòng)， 于 37度水浴中保溫，并于 lmin內(nèi)輕輕滴加 50%PEG4000，同時(shí)用吸管尖輕輕攪動(dòng) 60～ 90s，然后于2min內(nèi)緩慢滴加 20mlDMEM培養(yǎng)液， 1500r／ min離心 8～10min，吸去上清液，然后再用含 20%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)液稀釋至 50ml，制成細(xì)胞懸浮液， 得細(xì)胞融合混合物 .取 25ml融合混合物加至兩塊含飼養(yǎng)細(xì)胞的 24孔微量培養(yǎng)板中，每孔加 ； 余下 25ml細(xì)胞融合混合物再用含 20%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)液稀釋至 50m1，依上法再接種兩塊 24孔培養(yǎng)板． 依此類推，每次融合混合物可按種 8— 10塊 24孔培養(yǎng)板，按 IR983 F計(jì)，每孔接種細(xì)胞數(shù)約為 105個(gè)，剩余融合物棄去． 若用 96孔板，則每孔接種細(xì)胞數(shù)約為 104個(gè)．然后于 37度， C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至 2～ 4天，每天從各孔中吸去 lml原培養(yǎng)液，替換含 20%小牛血清及 HAT的 DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至第 5— 6天可見小克隆，至 9～ 10天可見大克隆，中途不換 HT培養(yǎng)液。 另取 HBsAg用 ， ／ L磷酸緩沖液溶解并稀釋成 20μg／ ml的溶液，加等體積福氏完全佐劑充分乳化后，取 2ml注入 Lou／ c大鼠腹腔， 2周后進(jìn)行第 2次 免疫 ， 3個(gè)月后于融合前 3— 4天進(jìn)行 加強(qiáng)免疫 ， 3次免疫的劑量和注射途徑均相同，唯第 3次免疫時(shí)不加福氏佐劑， 于細(xì)胞融合前處死大鼠，用碘酒棉球及酒精棉球先后對(duì)右上腹部消毒，剖開腹部，用無菌剪刀與鑷子取出 脾臟 ，用， ／ L磷酸緩沖液洗去血液，在無菌燒杯或培養(yǎng)皿中切成 1mm3小塊，再用磷酸緩沖液洗滌 3～ 4次，直至澄清，傾去洗滌液， 加入組織塊 5～ 6倍體積 (質(zhì)量／體積 )的 %胰蛋白酶溶液 (— )于 37度 保溫，消化 20一 40min，每 10min輕搖消化瓶 1次，直至組織塊松軟為止，傾去胰蛋白酶溶液，再用上述磷酸緩沖液洗滌 3～ 5次，然后加入少量磷酸緩沖液用 10ml吸管吹打分散，至大部分組織塊分散為細(xì)胞， 用兩層無菌 紗布過濾 ，未分散的組織塊再加少量磷酸緩沖液吹打和分散，合并細(xì)胞濾液，離心收集細(xì)胞并用磷酸緩沖液洗滌 2— 3次，然后用無血清的 DMEM培養(yǎng)液稀釋制成細(xì)胞懸浮液，即為免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞親本，備用。 ②飼養(yǎng)細(xì)胞制備： 在細(xì)胞融合前 2～ 3天，取健康大鼠處死，向腹腔內(nèi)注入10mlDMEM培養(yǎng)液． 輕壓腹腔使細(xì)胞懸浮，打開腹壁皮膚，暴露腹膜，提起腹膜中心，插入注射針頭，吸出全部細(xì)胞懸液； 500g離心 5min，用 ， ／ L磷酸緩沖液洗滌 23次； 收集細(xì)胞，用含 10％小牛血清、 100U／ ml青霉素和鏈霉素及 HAT的 DMEM培養(yǎng)液制成 106細(xì)胞／ ml懸浮液； 使用 24孔板時(shí)，每孔加 ，當(dāng)使用 96孔板時(shí)，則制成2x105細(xì)胞／ ml的懸浮液，每孔加 ， 然后置 37℃ 的 CO2培養(yǎng)箱中溫育，備用。 使 Eagle培養(yǎng)基中 15種氨基酸濃度增加 1倍， 8種維生素濃度增加 3倍而成，用于細(xì)胞培養(yǎng)，提高了細(xì)胞生長(zhǎng)效果。 （五）單克隆抗體生產(chǎn)工藝實(shí)例 免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞與大鼠骨髓瘤的 IR983F細(xì)胞融合技術(shù)制造抗 HBsAg單克隆抗體的工藝。 抗 HBsAg的單克隆抗體生產(chǎn)工藝 抗乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)單克隆抗體是專一性識(shí)別HBsAg的單一抗體，能與 HBsAg產(chǎn)生免疫反應(yīng)。 先克隆出細(xì)胞基因，再利用基因重組技術(shù)去除毒素中非特異性結(jié)合部位基因，經(jīng)過改造的毒素基因再與載體基因的互補(bǔ) DNA重組，轉(zhuǎn)入受體菌中表達(dá)，形成融合蛋白，再經(jīng)純化可得到重組的免疫毒素。 免疫毒素的制備 來源 :主要是細(xì)菌毒素和植物毒素。 毒素偶聯(lián)的抗體藥物 免疫毒素及其換代制品 毒素和抗體的交聯(lián)物稱為 免疫毒素 。 抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物 （ 1） 、常用抗癌藥 氨甲喋呤、阿霉素、絲裂霉素、環(huán)磷酰胺等，以人血清白蛋白為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的氨甲喋呤量，使體外細(xì)胞毒性提高倍。 蛋白質(zhì)提純： 以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物的研究已有近 20年的歷史，已制備出百余種單克隆抗體，鑒定出數(shù)十種與腫瘤相關(guān)的抗原，但治療試劑還沒有達(dá)到商品化。 單克隆抗體在腫瘤治療方面目前正顯示著巨大的優(yōu)勢(shì) ， 其中治療效果較好的有白血病 、 淋巴瘤 、 腎癌 、 肉瘤 、 黑色素瘤 、 肝癌以及胃腸道腫瘤等 。 紅細(xì)胞表面的糖蛋白： A、 B型 AB型：兩種都帶 O型：兩種血型物質(zhì)都不帶 法國(guó)輸血中心還研制出了可分辯 A型、 B型、 AB型血型的單克隆抗體診斷盒。 利用雜交瘤技術(shù) 生產(chǎn)單克隆抗體的必備條件： 一個(gè)親本是能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞 另一親本是能夠無限生長(zhǎng)繁殖 的細(xì)胞。 利用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體經(jīng)歷了一個(gè)漫長(zhǎng)的發(fā)展階段。 （一）、單克隆抗體 二、雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體 單克隆抗體特點(diǎn) 高度特異性 過于單一性 高度穩(wěn)定性 高抗體活性 不可知性 （二）雜交瘤技術(shù) 通過雜交瘤技術(shù)獲得的雜交瘤細(xì)胞具備兩種親本細(xì)胞的特性。 單 克 隆 抗 體(Monoclonal antibody,McAb) 也稱為單抗 。 體液免疫： 體液免疫的發(fā)生分為： 感應(yīng)、反應(yīng)和效應(yīng)三個(gè)階段。 特異性免疫： 當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激后，一類小淋巴細(xì)胞 依賴胸腺的 T細(xì)胞發(fā)生增生、分化，直接攻擊靶細(xì)胞或間接地釋放一些淋巴因子，從而使機(jī)體達(dá)到免疫的過程。 非特異性免疫 個(gè)體在生活過程中，因受到某些病原微生物感染或接種疫苗而獲得的免疫稱為獲得性免疫。 一、免疫系統(tǒng) 個(gè)體對(duì)抗原性異物的抵抗力，有些是天生的，即在發(fā)育進(jìn)化過程中形成的，經(jīng)遺傳獲得的，稱為先天性免疫。 從 1939年 立了植物細(xì)胞和器官培養(yǎng)技術(shù)以來，經(jīng)科學(xué)家們半個(gè)世紀(jì)的努力，目前藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在選材消毒、接種培養(yǎng)、誘導(dǎo)篩選、繼代保存、成分分離鑒定和工業(yè)化生產(chǎn)方面已發(fā)展成一門精細(xì)的實(shí)驗(yàn)科學(xué)，并已建立了一套操作程序。 在次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中，藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是通過給予體外生長(zhǎng)的植物細(xì)胞一定的營(yíng)養(yǎng)條件，使其生長(zhǎng)，并根據(jù)植物或植物不同組織的細(xì)胞調(diào)節(jié)生長(zhǎng)條件來獲取所需的次生代謝產(chǎn)物的生物技術(shù)。 十、藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)的研究 1. 藥用植物次生代謝產(chǎn)物 藥用植物次生代謝產(chǎn)物是指藥用植物體內(nèi)的一大類化合物，它們是細(xì)胞生命活動(dòng)或植物生長(zhǎng)發(fā)育正常運(yùn)行的非必需的小分子化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的特異性。 選用松散易分散的起始材料，培養(yǎng)過程中隨時(shí)除去細(xì)胞團(tuán)塊，提高生長(zhǎng)素的濃度向培養(yǎng)基中加入 EDTANa螯合劑和果膠酶等。 縮短生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本 篩選有效成分高的細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)。 可以不受環(huán)境因素，能在任何地方與任何時(shí)候進(jìn)行生產(chǎn)，培養(yǎng)物能達(dá)到在田中生產(chǎn)的材料中從未見到的那種整齊一致的程度； 八、植物細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)越性 任何新發(fā)現(xiàn)的植物種類都能立即著手培養(yǎng)，并能縮短繁殖和引種栽培的時(shí)間； 植物細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)越性： 人工控制有毒藥物的擴(kuò)散和濫用； 植物細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)越性： 植物組織培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)無需占用耕地，培養(yǎng)物生長(zhǎng)迅速，周期短，能夠在人工控制的條件下，采用科學(xué)方法提高產(chǎn)量和質(zhì)量。 生物轉(zhuǎn)化 植物細(xì)胞內(nèi)含有催化酯化、氧化、還原、皂化、羧基化、異構(gòu)化、甲基化、羥基化、環(huán)氧化、去甲基化等反應(yīng)的酶類，可使相應(yīng)的原料生成有用化合物。 植物細(xì)胞： 目前來自植物細(xì)胞培養(yǎng)的有用物質(zhì)有 400種左右 ， 包括色素 、 固醇 、 生物堿 、 維生素 、 激素 、 多糖 、 植物殺蟲劑及生長(zhǎng)激素等數(shù)十個(gè)類別 。如人參細(xì)胞