【正文】 的互補(bǔ) DNA重組，轉(zhuǎn)入受體菌中表達(dá)，形成融合蛋白，再經(jīng)純化可得到重組的免疫毒素。 免疫毒素的臨床應(yīng)用 可用于治療腫瘤、自身免疫病、并能克服組織移植排斥反應(yīng)，可單獨(dú)給藥也可包裹在脂質(zhì)體及其他微粒中給藥，在胞漿物質(zhì)代謝中發(fā)揮作用，相對(duì)分子量小，滲透力強(qiáng)、效果好。 抗 HBsAg的單克隆抗體生產(chǎn)工藝 抗乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)單克隆抗體是專一性識(shí)別HBsAg的單一抗體，能與 HBsAg產(chǎn)生免疫反應(yīng)。 臨床上用于檢測(cè)乙型肝炎病毒的感染并用于生產(chǎn)預(yù)防乙肝的免疫制劑，目前生產(chǎn)抗 HBsAg的單克隆抗體技術(shù)有基因工程與細(xì)胞工程。 （五）單克隆抗體生產(chǎn)工藝實(shí)例 免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞與大鼠骨髓瘤的 IR983F細(xì)胞融合技術(shù)制造抗 HBsAg單克隆抗體的工藝。 (1)工藝流程 大鼠骨髓瘤細(xì)胞 +免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞 融合混合物 雜種細(xì)胞混合物 雜交瘤克隆系 細(xì)胞種質(zhì) 培養(yǎng)液 粗制 McAb 層析液 濃縮液 McAb精品 (2)工藝過(guò)程 ①培養(yǎng)基： 大鼠骨髓瘤 IR983 F細(xì)胞系的培養(yǎng)基為 改良的 (DMEM)培養(yǎng)基。 使 Eagle培養(yǎng)基中 15種氨基酸濃度增加 1倍， 8種維生素濃度增加 3倍而成，用于細(xì)胞培養(yǎng)，提高了細(xì)胞生長(zhǎng)效果。 其中尚需 10%滅活小牛血清， 1%非必需氨基酸， ／ L丙酮酸鈉， 1%谷氨酰胺及 50mg／ mI慶大霉素；雜交瘤細(xì)胞篩選系統(tǒng)用含 HAT的 DMEM培養(yǎng)基。 ②飼養(yǎng)細(xì)胞制備： 在細(xì)胞融合前 2～ 3天，取健康大鼠處死，向腹腔內(nèi)注入10mlDMEM培養(yǎng)液． 輕壓腹腔使細(xì)胞懸浮，打開(kāi)腹壁皮膚，暴露腹膜，提起腹膜中心，插入注射針頭，吸出全部細(xì)胞懸液； 500g離心 5min，用 ， ／ L磷酸緩沖液洗滌 23次； 收集細(xì)胞，用含 10％小牛血清、 100U／ ml青霉素和鏈霉素及 HAT的 DMEM培養(yǎng)液制成 106細(xì)胞／ ml懸浮液； 使用 24孔板時(shí)，每孔加 ，當(dāng)使用 96孔板時(shí)，則制成2x105細(xì)胞／ ml的懸浮液，每孔加 ， 然后置 37℃ 的 CO2培養(yǎng)箱中溫育，備用。 ③親本細(xì)胞準(zhǔn)備： 取對(duì) 8— 氮鳥(niǎo)嘌呤抗性的 Lou／ c大鼠 非分泌型漿細(xì)胞瘤IR983F細(xì)胞 ，用常規(guī)方法制成細(xì)胞懸浮液，按 ／ ml接種量 接種 于 DMEM培養(yǎng)液中，于 37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)常規(guī)消化分散法用 DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸浮液，即為待融合用 骨髓瘤細(xì)胞 親本，備用。 另取 HBsAg用 ， ／ L磷酸緩沖液溶解并稀釋成 20μg／ ml的溶液，加等體積福氏完全佐劑充分乳化后，取 2ml注入 Lou／ c大鼠腹腔， 2周后進(jìn)行第 2次 免疫 ， 3個(gè)月后于融合前 3— 4天進(jìn)行 加強(qiáng)免疫 ， 3次免疫的劑量和注射途徑均相同，唯第 3次免疫時(shí)不加福氏佐劑， 于細(xì)胞融合前處死大鼠，用碘酒棉球及酒精棉球先后對(duì)右上腹部消毒，剖開(kāi)腹部，用無(wú)菌剪刀與鑷子取出 脾臟 ，用， ／ L磷酸緩沖液洗去血液，在無(wú)菌燒杯或培養(yǎng)皿中切成 1mm3小塊，再用磷酸緩沖液洗滌 3～ 4次，直至澄清，傾去洗滌液， 加入組織塊 5～ 6倍體積 (質(zhì)量／體積 )的 %胰蛋白酶溶液 (— )于 37度 保溫，消化 20一 40min，每 10min輕搖消化瓶 1次，直至組織塊松軟為止，傾去胰蛋白酶溶液，再用上述磷酸緩沖液洗滌 3～ 5次，然后加入少量磷酸緩沖液用 10ml吸管吹打分散，至大部分組織塊分散為細(xì)胞， 用兩層無(wú)菌 紗布過(guò)濾 ，未分散的組織塊再加少量磷酸緩沖液吹打和分散，合并細(xì)胞濾液，離心收集細(xì)胞并用磷酸緩沖液洗滌 2— 3次，然后用無(wú)血清的 DMEM培養(yǎng)液稀釋制成細(xì)胞懸浮液，即為免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞親本，備用。 ④固定化抗大鼠 K輕鏈單抗的制備： 本法所用載體也為 Sepharose 4B，其活化方法與制備固定化 tPA相同． 取 30g活化的 Sepharose 4B懸浮于 100ml， ， 緩沖液中，另取 1g抗大鼠 K輕鏈的 McAb(MARK1)溶于 25ml硼酸緩沖液， 然后加至上述已活化的 Sepharose 4B懸浮物中，于 10度攪拌反應(yīng) 16～20h，將其裝柱 (直徑 2cm*50cm)并用 10倍柱床體積 (體積／體積 )的上述硼酸緩沖液以 5— 6ml／ min流速洗滌柱床，收集流出液， 測(cè) A280并根據(jù)流出液計(jì)算偶聯(lián)效率．然后依次用 5倍柱床體積 (體積／體積 )的 pH10， ， ／ L硼酸緩沖液充分洗滌． 最后用 ， ，即得抗HBsAg McAb的親和吸附劑，將其轉(zhuǎn)移至含 ， 磷酸緩沖液中，于 4℃ 貯存，備用。 ⑤細(xì)胞融合： 取 107個(gè) IR983 F細(xì)胞與 108個(gè)免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞于50mi離心管中，混勻，在 4度下， 1500r／ min離心 8— 10min，用巴斯德吸管小心吸去上清液，輕彈管底，使沉淀的細(xì)胞松動(dòng)， 于 37度水浴中保溫，并于 lmin內(nèi)輕輕滴加 50%PEG4000，同時(shí)用吸管尖輕輕攪動(dòng) 60～ 90s，然后于2min內(nèi)緩慢滴加 20mlDMEM培養(yǎng)液， 1500r／ min離心 8～10min，吸去上清液，然后再用含 20%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)液稀釋至 50ml，制成細(xì)胞懸浮液， 得細(xì)胞融合混合物 .取 25ml融合混合物加至兩塊含飼養(yǎng)細(xì)胞的 24孔微量培養(yǎng)板中，每孔加 ； 余下 25ml細(xì)胞融合混合物再用含 20%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)液稀釋至 50m1，依上法再接種兩塊 24孔培養(yǎng)板． 依此類推，每次融合混合物可按種 8— 10塊 24孔培養(yǎng)板，按 IR983 F計(jì)，每孔接種細(xì)胞數(shù)約為 105個(gè)，剩余融合物棄去． 若用 96孔板，則每孔接種細(xì)胞數(shù)約為 104個(gè)．然后于 37度， C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至 2～ 4天，每天從各孔中吸去 lml原培養(yǎng)液，替換含 20%小牛血清及 HAT的 DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至第 5— 6天可見(jiàn)小克隆，至 9～ 10天可見(jiàn)大克隆，中途不換 HT培養(yǎng)液。 若培養(yǎng)液出現(xiàn)淡黃色，可取出一部分培養(yǎng)液進(jìn)行抗體檢測(cè)。培養(yǎng) 10天后改換含 HT的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)兩周后改用常規(guī) DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。 ⑥雜交瘤細(xì)胞篩選： 篩選產(chǎn)生抗 HBsAg單抗的雜交瘤細(xì)胞的方法是用 AUSAB酶免疫試劑盒 測(cè)定表達(dá)抗體的細(xì)胞， 即將包被了人 HBsAg的聚苯乙烯珠與待測(cè)雜交瘤培養(yǎng)上清培育，然后用磷酸緩沖液洗滌 3— 4次，加入用生物素偶聯(lián)的HBsAg培育后洗滌，再加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素培育，最后用鄰苯二胺 (OPD)顯色，經(jīng)酶標(biāo)儀定量測(cè)定，以確定產(chǎn)生抗 HBsAg單抗的陽(yáng)性孔。 經(jīng)檢測(cè)確定為產(chǎn)生抗 HBsAg單抗的陽(yáng)性孔細(xì)胞需進(jìn)行克隆和再克隆，井經(jīng)全面鑒定與分析，最后才能獲得產(chǎn)生抗HBsAg單抗的雜交瘤克隆系。 其過(guò)程如下： 將陽(yáng)性孔中的培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)常規(guī)消化分散法制成細(xì)胞懸浮液，計(jì)數(shù)，用含 20%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)液依次稀釋成5X104細(xì)胞／ ml， 5X103細(xì)胞／ ml、 5X102細(xì)胞／ m1及5X10細(xì)胞／ ml細(xì)胞懸液， 然后在已有飼養(yǎng)細(xì)胞的 96孔培養(yǎng)板的第 1一 3行中，每孔接種 5x10細(xì)胞／ ml細(xì)胞懸液 ，每孔細(xì)胞數(shù)平均為 5個(gè)； 余下細(xì)胞懸液再稀釋成 10細(xì)胞／ ml，在第 4— 6行孔中每孔接種 ，平均每孔細(xì)胞數(shù)為 1個(gè)； 余下細(xì)胞懸液再稀釋成 2細(xì)胞／ ml，在 7～ 8行孔中每孔接種 ，平均每孔 . 然后于 37度， CO2培養(yǎng)箱中通入含 5％ CO2的無(wú)茵空氣培養(yǎng)至第 5一 6天，鏡檢，記下單克隆孔，補(bǔ)加 。 在生長(zhǎng)良好的情況下，第 1～ 3行難有單克隆，第 4— 6行偶有單克隆，第 7— 8行多為單克?。? 培養(yǎng)至 9～ 10天后有部分孔中培養(yǎng)液上清液變 淡黃色 ，可能已有抗體產(chǎn)生。然后將陽(yáng)性孔內(nèi)細(xì)胞分散接種至另外的 24孔板中培養(yǎng)，并在原版的各孔中替換另 — 批培養(yǎng)液，以防污染及細(xì)胞死亡。 當(dāng)新的 24孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)，即進(jìn)行消化分散轉(zhuǎn)移至小方瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)將種質(zhì)進(jìn)行保存。所獲的陽(yáng)性培養(yǎng)物需按上述方法反復(fù)再克隆和全面鑒定，直至確證為陽(yáng)性單克隆為止。 ⑦抗 HBsAg單克隆抗體的生產(chǎn)： 抗 HBsAg的單克隆抗體可采用人工生物反應(yīng)器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，也可采用動(dòng)物體作為生物反應(yīng)器進(jìn)行生產(chǎn)，后者又可通過(guò)誘發(fā)實(shí)體瘤及腹水瘤進(jìn)行生產(chǎn)，本文敘述腹水瘤生產(chǎn)技術(shù)，其過(guò)程如下： 向健康的 Lou／ c大鼠腹腔注射 1ml降植烷 (Pristane)，飼養(yǎng) 1— 9周后，向大鼠腹腔接種 5x106個(gè)雜交瘤細(xì)胞， 飼養(yǎng) 9～ 11天后即可明顯產(chǎn)生腹水，待腹水量達(dá)到最大限度而大鼠又瀕于死亡之前時(shí)，處死動(dòng)物，用毛細(xì)管抽取腹水，一般可得 50ml左右。 同時(shí)也可取其血清分離抗體，此外也可不處死動(dòng)物，而是每 1～ 3天抽取 1次腹水，通常每一動(dòng)物可抽取 10次以上，從而獲得更多單克隆抗體。 ⑧抗 HBsAg單抗的分離純化： 將固定化抗大員 K輕鏈的 Sepharose 4B親和吸附劑 裝柱 (直徑 4cmX20cm)。 用 5倍柱床體積 (體積／體積 )的 ， 液以 2～ 3m1／ min流速洗滌和平衡柱床， 然后將 100ml含抗 HBsAg單抗的腹水用生理鹽水稀釋 5倍 {體積／體積 )，以 2m1／ min流速進(jìn)柱，然后用 ， 酸緩沖液洗滌柱床， 同時(shí)測(cè)定 A280，等第一個(gè)雜 蛋白峰 洗出后，改用含 ／ LNaCl的上述磷酸緩沖液洗滌，除去非特異性吸附的雜蛋白， 然后用 HCl緩沖液洗脫，同時(shí)分部收集洗脫液，合并含單抗的洗脫液，立即用 ， 緩沖液中和至 ， 經(jīng)超濾，濃縮及凍于后即得抗 HBsAg的 單克隆抗體精品 。 作業(yè)： 動(dòng)、植物細(xì)胞與微生物細(xì)胞相比有哪些培養(yǎng)特征。 簡(jiǎn)述動(dòng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)條件。