【正文】 胞具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，因此通常需用酶將其壁降解。 （ 6） 6— 24小時(shí)后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。 聚乙二醇（ PEG）法 聚乙二醇（ PEG）法細(xì)胞融合過(guò)程 ?PEG的作用機(jī)理 ： 由于 PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成 H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外， PEG能增加類脂膜的流動(dòng)性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。 ?PEG濃度以 W/W；如將 10克 PEG與 10mlEagLe氏液混合（假定 1ml 培養(yǎng)液為 1g重 )，即成 50％ PEG溶液。 四、細(xì)胞融合的方法 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有 3種 :生物方法 (常用仙臺(tái)病毒 ) 化學(xué)方法 (常用聚乙二醇 ) 物理方法 (電激和激光 ) 仙臺(tái)病毒法 ① 兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近； ② 通過(guò)病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透； ③ 兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，兩個(gè)細(xì)胞融為一體； ④ 進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。 二、細(xì)胞融合研究進(jìn)展 生物種類 細(xì)胞來(lái)源 成功年代 煙草兩個(gè)種間 苷藍(lán) —— 青菜 大豆 —— 馬唐草 矮牽牛 —— 龍面花 大麥 —— 花生 大麥 —— 大豆 小麥 —— 矮牽牛 油菜 —— 大豆 玉米 —— 大豆 大豆 —— 野豌豆 大麥 —— 蠶豆 大豆 —— 草香木犀 酵母菌 —— 雞 大豆 —— 煙草 大豆 —— 秋水仙 人 —— 胡蘿卜 番茄 —— 馬鈴薯 人 —— 小鼠 葉 —— 葉 葉 —— 根 愈傷組織 —— 葉 葉 —— 花瓣 種子 —— 種子 葉 —— 懸浮細(xì)胞 葉 —— 花瓣 葉 —— 懸浮細(xì)胞 葉 —— 懸浮細(xì)胞 懸浮細(xì)胞 —— 懸浮細(xì)胞 葉 —— 根 懸浮細(xì)胞 —— 葉 原生質(zhì)體 —— 血紅細(xì)胞 懸浮細(xì)胞 —— 葉 懸浮細(xì)胞 —— 葉 腹水癌細(xì)胞 —— 原生質(zhì)體 葉 —— 根尖 纖維肉瘤細(xì)胞 —— 畸胎瘤細(xì)胞 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 幾種細(xì)胞融合成功的例子 植物融合細(xì)胞成長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)比 ,右瓶為地面融合的細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)使用的小白鼠 三、細(xì)胞融合的意義 ?理論上說(shuō)任何細(xì)胞，都有可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。 ?1958年日本學(xué)者岡田（ Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒具有觸發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合的效應(yīng)。 ?Virchow于 1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。 1665年英國(guó)物理學(xué)家胡克用自制的顯微鏡發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞 . 胡克所用的顯微鏡及觀察的櫟樹(shù)細(xì)胞壁 1674年荷蘭科學(xué)家列文虎克才真正觀察到了細(xì)胞 細(xì)胞是一切生命活動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。 第一節(jié) 細(xì)胞融合 細(xì)胞融合 （ cell fusion)，又稱體細(xì)胞雜交（ somatichybridiazation），是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過(guò)膜融合形成單個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。 ?Luginbuhl于 1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。 ?1974年華裔加拿大學(xué)者高國(guó)楠?jiǎng)?chuàng)立了聚乙二醇（ PEG）化學(xué)融合法。這對(duì)于種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。 ? 仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段： 病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如下： ① 兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在 4℃ 條件下病毒附著在細(xì)胞膜上。 ?PEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬?Engle氏液混合。 ?PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn) ： 其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。 電融合法 電融合法是 80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開(kāi)始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。動(dòng)物細(xì)胞則無(wú)此障礙。 植物細(xì)胞融合過(guò)程 人造小鼠培育過(guò)程示意圖 七、 雜種細(xì)胞的篩選 根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型： ?異核細(xì)胞：非同源細(xì)胞的融合體。 但細(xì)胞在離體培養(yǎng)時(shí)形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，根據(jù)不同的需要將離體培養(yǎng)的細(xì)胞分為： 貼壁細(xì)胞 、 懸浮細(xì)胞 和 兼性貼壁細(xì)胞 。 （ 2）、 非 貼壁細(xì)胞 （ anchoragedindependent cell ） 生長(zhǎng)不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)。 理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞系 動(dòng)物細(xì)胞生理特點(diǎn) （ 1）分裂期長(zhǎng) ，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易受微生物污 染，培養(yǎng)時(shí)需要抗生素。 （ 4）動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分敏感。蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化修飾后與天然產(chǎn)物更一致，適合于臨床應(yīng)用。 二倍體細(xì)胞 通過(guò)轉(zhuǎn)化形成，變成了異倍體，有無(wú)限增殖能力。 CHOK1：從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞，用于 構(gòu)建工程菌。 Namalwa：從淋巴瘤病人分離，生產(chǎn)干擾素。 （ 3）滲透壓： 在細(xì)胞培養(yǎng)的所有操作中，為了使與細(xì)胞接觸的所有液體都保持較合適的滲透壓 和 pH,都必須采用等滲的溶液。 動(dòng)物培養(yǎng)基的種類和組成 （ 1）、天然培養(yǎng)基：血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。 （ 2） 提供結(jié)合蛋白質(zhì) ， 能識(shí)別維生素 、 脂類 、 金屬和其他激素等 。 （ 2） 在進(jìn)行細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)研究時(shí) ， 由于血清組成的復(fù)雜和不穩(wěn)定 ， 妨礙對(duì)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)要求的確切了解 。 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，放大效應(yīng)小，設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，可以借鑒微 生物工程的經(jīng)驗(yàn)。生產(chǎn)上一般采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，具有投資少、設(shè)備簡(jiǎn)單、技術(shù)成熟、重現(xiàn)性高、放大只是簡(jiǎn)單地增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)的優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)： 勞動(dòng)強(qiáng)度大、操作手續(xù)繁瑣、占用空間大、按體積 計(jì)算產(chǎn)率低、監(jiān)測(cè)和控制環(huán)境條件受到限制等。微鏡觀察即能監(jiān)測(cè)出細(xì)胞在微珠表面的生長(zhǎng)情況 。 h. 培養(yǎng)系統(tǒng)占用空間小。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧可通過(guò)膜孔進(jìn)入囊內(nèi)，細(xì)胞代謝的小分子產(chǎn)物可排出囊外，分泌的大分子產(chǎn)物，不能透過(guò)膜孔，積聚在囊內(nèi)。細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)不斷消耗，產(chǎn)物不斷形成。 3 、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器 ① 優(yōu)良的傳質(zhì)、傳熱、混合性能，且對(duì)動(dòng)物細(xì)胞剪切力小 。 ⑤ 密封性能好。 （ 4）直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高，液體循環(huán)量大，使細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)成分能均勻地分布于培養(yǎng)基中。在適宜條件下，任何一個(gè)細(xì)胞都可以發(fā)育成一個(gè)新個(gè)體。 三、植物細(xì)胞特性 細(xì)胞形態(tài)特征： 在間歇培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)初期，多半是比較大的游離細(xì)胞，接著便開(kāi)始分裂，隨著分裂，原來(lái)較大的細(xì)胞分裂成一個(gè)一個(gè)較小的細(xì)胞，同時(shí)，較小的細(xì)胞聚集成細(xì)胞塊，在生長(zhǎng)停止后，細(xì)胞伸長(zhǎng)、肥大，塊狀細(xì)胞游離分散。 （ 一般為 50～ 100r/min， 通氣為： m3/ m3 植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)的比較 特性 微生物 植物細(xì)胞 大小 2 μ m3 ＞ 105 μ m3 單一細(xì)胞 經(jīng)常 一般以群體發(fā)育 由單細(xì)胞生長(zhǎng)成細(xì)胞群 是 少有 加成時(shí)間 大于 1h 1d 接種濃度 小 細(xì)胞在培養(yǎng)液中濃度為 5% ～ 20% 染色體數(shù)目 單或雙倍體 單、雙、多及不定倍體混合生長(zhǎng) 切力 不敏感 敏感 單一培養(yǎng)的變異 安定 變異很大 發(fā)育 可形成孢子或假菌絲 形成器官或胚 通氣需求 高， 1 ～ 2m3/ 低， ～ 產(chǎn)物形成 進(jìn)入菌絲 進(jìn)入液泡 四、植物細(xì)胞培養(yǎng)條件 （一 )、外植體的制備 所謂的外植體是指將外界生長(zhǎng)的植物的細(xì)胞和組織經(jīng)過(guò)一系列的無(wú)菌處理形成的有活性的無(wú)菌組織和細(xì)胞。 （三）、人工培養(yǎng)環(huán)境 能否把植物組織培養(yǎng)做到滿意的人工調(diào)控，關(guān)鍵在于人工培養(yǎng)環(huán)境，包括光照、溫度、 濕度、培養(yǎng)基等。 。 （ 3）植物生長(zhǎng)刺激物質(zhì)： 植物天然的 5類激素物質(zhì)有： 生長(zhǎng)素類、細(xì)胞分裂素類、赤霉素類、脫落素類和乙烯類。 （ 4）其他附加物： 植物天然汁液如西瓜汁、生梨汁等，它們的作用是供給一些必需的微量營(yíng)養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長(zhǎng)激素物質(zhì)等。 溫度 pH值 通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行的 H+離子傳遞對(duì)細(xì)胞的生育環(huán)境、生理活性來(lái)說(shuō)無(wú)疑是重要的。好氣培養(yǎng)系統(tǒng)的通氣與混合及攪拌是相互關(guān)聯(lián)的。 Kessell和 Carr在驗(yàn)證溶解氧對(duì)攪動(dòng)通氣培養(yǎng)的胡蘿卜細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響時(shí) ， 發(fā)現(xiàn)有一個(gè)臨界氧水平 。用于研究植物的生長(zhǎng)發(fā)育、分化和遺傳變異；進(jìn)行無(wú)性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。 首