【正文】 胞具有堅硬的細胞壁，因此通常需用酶將其壁降解。 （ 6） 6— 24小時后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細胞。 聚乙二醇（ PEG）法 聚乙二醇（ PEG）法細胞融合過程 ?PEG的作用機理 ： 由于 PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成 H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進而促使質(zhì)膜的融合；另外， PEG能增加類脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。 ?PEG濃度以 W/W；如將 10克 PEG與 10mlEagLe氏液混合（假定 1ml 培養(yǎng)液為 1g重 )，即成 50％ PEG溶液。 四、細胞融合的方法 誘導細胞融合的方法有 3種 :生物方法 (常用仙臺病毒 ) 化學方法 (常用聚乙二醇 ) 物理方法 (電激和激光 ) 仙臺病毒法 ① 兩個原生質(zhì)體或細胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近； ② 通過病毒與原生質(zhì)體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透； ③ 兩個原生質(zhì)體的細胞核互相融合，兩個細胞融為一體； ④ 進入正常的細胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細胞。 二、細胞融合研究進展 生物種類 細胞來源 成功年代 煙草兩個種間 苷藍 —— 青菜 大豆 —— 馬唐草 矮牽牛 —— 龍面花 大麥 —— 花生 大麥 —— 大豆 小麥 —— 矮牽牛 油菜 —— 大豆 玉米 —— 大豆 大豆 —— 野豌豆 大麥 —— 蠶豆 大豆 —— 草香木犀 酵母菌 —— 雞 大豆 —— 煙草 大豆 —— 秋水仙 人 —— 胡蘿卜 番茄 —— 馬鈴薯 人 —— 小鼠 葉 —— 葉 葉 —— 根 愈傷組織 —— 葉 葉 —— 花瓣 種子 —— 種子 葉 —— 懸浮細胞 葉 —— 花瓣 葉 —— 懸浮細胞 葉 —— 懸浮細胞 懸浮細胞 —— 懸浮細胞 葉 —— 根 懸浮細胞 —— 葉 原生質(zhì)體 —— 血紅細胞 懸浮細胞 —— 葉 懸浮細胞 —— 葉 腹水癌細胞 —— 原生質(zhì)體 葉 —— 根尖 纖維肉瘤細胞 —— 畸胎瘤細胞 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 幾種細胞融合成功的例子 植物融合細胞成長狀態(tài)對比 ,右瓶為地面融合的細胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細胞 動物細胞融合實驗使用的小白鼠 三、細胞融合的意義 ?理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。 ?1958年日本學者岡田（ Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細胞融合的效應。 ?Virchow于 1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞現(xiàn)象。 1665年英國物理學家胡克用自制的顯微鏡發(fā)現(xiàn)了細胞 . 胡克所用的顯微鏡及觀察的櫟樹細胞壁 1674年荷蘭科學家列文虎克才真正觀察到了細胞 細胞是一切生命活動的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。 第一節(jié) 細胞融合 細胞融合 （ cell fusion)，又稱體細胞雜交（ somatichybridiazation），是指兩個或更多個相同或不同細胞通過膜融合形成單個細胞的過程。 ?Luginbuhl于 1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細胞存在。 ?1974年華裔加拿大學者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（ PEG）化學融合法。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。 ? 仙臺病毒誘導細胞融合經(jīng)四個階段： 病毒促使細胞融合的主要步驟如下： ① 兩種細胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在 4℃ 條件下病毒附著在細胞膜上。 ?PEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫熱的 Engle氏液混合。 ?PEG誘導融合的特點 ： 其優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。 電融合法 電融合法是 80年代出現(xiàn)的細胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導下，細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。動物細胞則無此障礙。 植物細胞融合過程 人造小鼠培育過程示意圖 七、 雜種細胞的篩選 根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型： ?異核細胞：非同源細胞的融合體。 但細胞在離體培養(yǎng)時形態(tài)會發(fā)生變化，根據(jù)不同的需要將離體培養(yǎng)的細胞分為： 貼壁細胞 、 懸浮細胞 和 兼性貼壁細胞 。 （ 2）、 非 貼壁細胞 （ anchoragedindependent cell ） 生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中懸浮生長。 理想的藥物生產(chǎn)細胞系 動物細胞生理特點 （ 1）分裂期長 ，細胞生長緩慢，易受微生物污 染，培養(yǎng)時需要抗生素。 （ 4）動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感。蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化修飾后與天然產(chǎn)物更一致，適合于臨床應用。 二倍體細胞 通過轉(zhuǎn)化形成，變成了異倍體，有無限增殖能力。 CHOK1：從中國倉鼠卵巢中分離的上皮樣細胞，用于 構(gòu)建工程菌。 Namalwa：從淋巴瘤病人分離，生產(chǎn)干擾素。 （ 3）滲透壓： 在細胞培養(yǎng)的所有操作中，為了使與細胞接觸的所有液體都保持較合適的滲透壓 和 pH,都必須采用等滲的溶液。 動物培養(yǎng)基的種類和組成 （ 1）、天然培養(yǎng)基：血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。 （ 2） 提供結(jié)合蛋白質(zhì) ， 能識別維生素 、 脂類 、 金屬和其他激素等 。 （ 2） 在進行細胞營養(yǎng)研究時 ， 由于血清組成的復雜和不穩(wěn)定 ， 妨礙對細胞營養(yǎng)要求的確切了解 。 優(yōu)點： 操作簡便，培養(yǎng)條件較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，放大效應小，設備相對簡單，可以借鑒微 生物工程的經(jīng)驗。生產(chǎn)上一般采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，具有投資少、設備簡單、技術(shù)成熟、重現(xiàn)性高、放大只是簡單地增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)的優(yōu)點 缺點： 勞動強度大、操作手續(xù)繁瑣、占用空間大、按體積 計算產(chǎn)率低、監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制等。微鏡觀察即能監(jiān)測出細胞在微珠表面的生長情況 。 h. 培養(yǎng)系統(tǒng)占用空間小。營養(yǎng)物質(zhì)和氧可通過膜孔進入囊內(nèi)，細胞代謝的小分子產(chǎn)物可排出囊外，分泌的大分子產(chǎn)物，不能透過膜孔，積聚在囊內(nèi)。細胞不斷生長，營養(yǎng)不斷消耗，產(chǎn)物不斷形成。 3 、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應器 ① 優(yōu)良的傳質(zhì)、傳熱、混合性能，且對動物細胞剪切力小 。 ⑤ 密封性能好。 （ 4）直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高，液體循環(huán)量大，使細胞和營養(yǎng)成分能均勻地分布于培養(yǎng)基中。在適宜條件下，任何一個細胞都可以發(fā)育成一個新個體。 三、植物細胞特性 細胞形態(tài)特征： 在間歇培養(yǎng)時，培養(yǎng)初期，多半是比較大的游離細胞，接著便開始分裂，隨著分裂，原來較大的細胞分裂成一個一個較小的細胞，同時，較小的細胞聚集成細胞塊，在生長停止后，細胞伸長、肥大，塊狀細胞游離分散。 （ 一般為 50～ 100r/min， 通氣為： m3/ m3 植物細胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)的比較 特性 微生物 植物細胞 大小 2 μ m3 ＞ 105 μ m3 單一細胞 經(jīng)常 一般以群體發(fā)育 由單細胞生長成細胞群 是 少有 加成時間 大于 1h 1d 接種濃度 小 細胞在培養(yǎng)液中濃度為 5% ～ 20% 染色體數(shù)目 單或雙倍體 單、雙、多及不定倍體混合生長 切力 不敏感 敏感 單一培養(yǎng)的變異 安定 變異很大 發(fā)育 可形成孢子或假菌絲 形成器官或胚 通氣需求 高， 1 ～ 2m3/ 低， ～ 產(chǎn)物形成 進入菌絲 進入液泡 四、植物細胞培養(yǎng)條件 （一 )、外植體的制備 所謂的外植體是指將外界生長的植物的細胞和組織經(jīng)過一系列的無菌處理形成的有活性的無菌組織和細胞。 （三）、人工培養(yǎng)環(huán)境 能否把植物組織培養(yǎng)做到滿意的人工調(diào)控，關(guān)鍵在于人工培養(yǎng)環(huán)境，包括光照、溫度、 濕度、培養(yǎng)基等。 。 （ 3）植物生長刺激物質(zhì)： 植物天然的 5類激素物質(zhì)有： 生長素類、細胞分裂素類、赤霉素類、脫落素類和乙烯類。 （ 4）其他附加物： 植物天然汁液如西瓜汁、生梨汁等，它們的作用是供給一些必需的微量營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長激素物質(zhì)等。 溫度 pH值 通過細胞膜進行的 H+離子傳遞對細胞的生育環(huán)境、生理活性來說無疑是重要的。好氣培養(yǎng)系統(tǒng)的通氣與混合及攪拌是相互關(guān)聯(lián)的。 Kessell和 Carr在驗證溶解氧對攪動通氣培養(yǎng)的胡蘿卜細胞生長和分化的影響時 ， 發(fā)現(xiàn)有一個臨界氧水平 。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和遺傳變異；進行無性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。 首