【正文】 cell ） 生長(zhǎng)時(shí)必須要有給以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長(zhǎng)和繁殖。 貼壁細(xì)胞 在表面上生長(zhǎng)時(shí)有兩種形態(tài) : 成纖維樣細(xì)胞型和上皮樣細(xì)胞型。 如：血液、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和某些轉(zhuǎn) 化細(xì)胞， Namalwa細(xì)胞。 如： CHO細(xì)胞、 BHK細(xì)胞、 L929細(xì)胞。 （ 2）細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象。 （ 3）正常二倍體細(xì)胞的壽命是有限的，正常二倍體細(xì)胞傳代培養(yǎng)都是有限的。 （ 5）動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求很高。多半可分泌到細(xì)胞外，提取純化方便 。 動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)藥物優(yōu)點(diǎn)： 缺點(diǎn)： 培養(yǎng)條件要求高、成本高、產(chǎn)量低。 原代細(xì)胞 原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代、篩選和克隆，從而從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。轉(zhuǎn)化可自發(fā)，在傳代過(guò)程中自己轉(zhuǎn)變成可無(wú)限增殖的細(xì)胞；也可人為轉(zhuǎn)化，采用某些試劑處理，或從動(dòng)物的腫瘤組織中建立的細(xì)胞系。 MRC5：人二倍體細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞，有限壽命 42 46代，用于制備疫苗。 BHK21：從倉(cāng)鼠幼鼠的腎臟中分離。 Vero： 從非洲綠猴腎中分離，貼壁依賴的成纖維細(xì) 胞，用于制備疫苗。 SP2/0Ag14：從抗羊紅細(xì)胞活性的小鼠脾細(xì)胞和骨髓 瘤細(xì)胞系融合獲得，生產(chǎn)單克隆抗體。 （ 2） pH： 影響細(xì)胞的存活力，生長(zhǎng)及代謝，細(xì)胞生長(zhǎng)的最適 pH因細(xì)胞類型不同而異，范圍為 。 （ 4）溫度： 動(dòng)物細(xì)胞對(duì)溫度特別敏感，一般動(dòng)物細(xì)胞特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最佳培養(yǎng)溫度為 (37士 ℃ ) 。 （ 6）滅菌： 所有的與細(xì)胞接觸的設(shè)備、器材和溶液都必須保持絕對(duì)無(wú)菌，避免污染。 （ 2）、合成培養(yǎng)基：組成穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)供應(yīng)，成分為氨基酸、維生素、糖類、無(wú)機(jī)鹽、小牛血清等。 （ 1） 提供激素及低分子量營(yíng)養(yǎng)物 。 （ 3） 有些情況下 ， 結(jié)合蛋白能與有毒金屬和熱 原結(jié)合 ， 起到解毒作用 （ 4） 起酸堿度緩沖劑作用 。 血清主要功能： （ 1） 在進(jìn)行激素和藥物研究時(shí) ， 血清成分與激素或藥物結(jié)合的結(jié)果 ， 干擾了其對(duì)細(xì)胞的作用 。 血清對(duì)實(shí)驗(yàn)的負(fù)面影響： （ 3）干擾對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞釋放產(chǎn)物的分析 （ 4）血清只能過(guò)濾消毒，過(guò)濾消毒只能除去細(xì)菌，但不能除去血清中可能含有的病毒和支原體。 五、動(dòng)物細(xì)胞 大規(guī)模 培養(yǎng)技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法 (1)懸浮培養(yǎng) （ 2）貼壁培養(yǎng) （ 3）貼壁 懸浮培養(yǎng) ①微載體培養(yǎng) ②包埋培養(yǎng) ③微曩培養(yǎng) (1)懸浮培養(yǎng) 所謂懸浮培養(yǎng)，是指細(xì)胞在生物反應(yīng)器中自由地懸浮于培養(yǎng)基中生長(zhǎng)增殖的過(guò)程。 缺點(diǎn)： 細(xì)胞密度較低。 優(yōu)點(diǎn)： 適用的細(xì)胞種類廣，較容易使細(xì)胞達(dá)到較 高密度。 （ 3）貼壁 懸浮培養(yǎng) ①微載體培養(yǎng) 微載體培養(yǎng)即 是指將貼附著貼壁細(xì)胞的微載體懸浮于培養(yǎng)基中，使細(xì)胞在微珠表面生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)方式。 b. 具有懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)兩種培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，簡(jiǎn)化了細(xì)胞生長(zhǎng)各種環(huán)境因素的檢測(cè)和控制，培養(yǎng)系統(tǒng)重現(xiàn)性好 。d. 培養(yǎng)基利用率高 。 f. 放大容易 ； g. 勞動(dòng)強(qiáng)度小 。 ② 包埋培養(yǎng) 將動(dòng) 物細(xì)胞與海藻酸鈉混勻 (此時(shí)呈液態(tài) )，然后將這種混合液滴入到 CaCl2溶液中，即形成海 藻酸鈣凝膠，此凝膠顆粒如上述微載體一樣可用于懸浮培養(yǎng)。 缺點(diǎn)： 存在擴(kuò)散 限制，如大分子基質(zhì)不能滲透進(jìn)凝膠內(nèi)，顆粒太大時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)不良 . ③微曩培養(yǎng) 把生物活性物質(zhì)完整的活細(xì)胞或組織包在薄的半透膜中，即稱為微囊技術(shù)。 優(yōu)點(diǎn)： ； ； c.分離純化操作經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便 ,產(chǎn)品純度高。 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)操作方式 （ 1）、分批式培養(yǎng) 分批式培養(yǎng)是指將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性裝人反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)后，將整個(gè)培養(yǎng)液 (連同細(xì)胞 )取出，進(jìn)行產(chǎn)物分離。 灌流式培養(yǎng)是指細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)基不斷加人反應(yīng)器，另一方面又將反應(yīng)液不斷地取出，但細(xì)胞停留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種恒定的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。 ② 理化參 數(shù)易于檢測(cè)和調(diào)節(jié)控制 。 ④ 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、清洗操作方便 。 理想的反應(yīng)器應(yīng)具備的性能 : （ 1）、通氣攪拌反應(yīng)器 （ 2）、氣升式生物反應(yīng)器： 空氣提升式生物反應(yīng)器兩種構(gòu)型： 內(nèi)循環(huán)式 、 外循環(huán)式 空氣流速一般控制在 ～ ,反應(yīng)器高徑比一般為 (3:1)～ (12:1) （ 1）沒(méi)有移動(dòng)部件，產(chǎn)生的湍動(dòng)溫和而均勻，剪切力相當(dāng)小，細(xì)胞損傷率比較低。 （ 3）設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，便于放大生產(chǎn)。 優(yōu)點(diǎn)： （ 3）、中空纖維生物反應(yīng)器 第三節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用 葉綠體 線粒體 細(xì)胞壁 細(xì)胞膜 液泡 細(xì)胞質(zhì) 光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 細(xì)胞核 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 高爾基體 植物 細(xì)胞培養(yǎng) 技術(shù)就是為了某種目的而在細(xì)胞水平上對(duì)離體植物細(xì)胞或原生質(zhì)體進(jìn)行的一系列生物工藝學(xué)操作。 一、概念 植物細(xì)胞全能性 二、植物細(xì)胞培養(yǎng)的 理論基礎(chǔ) 植物細(xì)胞全能性 （ totipotency）：指植物的每個(gè)細(xì)胞都包含著該物種的全部 遺傳信息 ，從而具備發(fā)育成完整植株的遺傳能力。 1958年，美國(guó)科學(xué)家斯圖爾德將胡蘿卜韌皮部的一些細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，由于細(xì)胞分化而最終發(fā)育成完整的新植株。 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中 ， 其細(xì)胞形態(tài)有明顯變化 。 植物細(xì)胞分批培養(yǎng)時(shí) ， 細(xì)胞生長(zhǎng)呈 S型曲線 ， 植物細(xì)胞生長(zhǎng)速度比較緩慢 。 不能耐受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌 。min） 植物細(xì)胞特性 培養(yǎng)過(guò)程生長(zhǎng)速度緩慢，易受微生物污染，需用抗生素。 植物細(xì)胞特性 植物細(xì)胞特性 植物細(xì)胞的二級(jí)代謝產(chǎn)物大都送到液泡內(nèi)堆積而非如微生物排出細(xì)胞外，目前產(chǎn)量較低。 制備外植體的原則是無(wú)菌和有活性，如果外植體被微生物污染則難以存活。事實(shí)上外植體的制備過(guò)程就是無(wú)菌處理過(guò)程，而其后的一系列操作都是在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行的。 培養(yǎng)基包括植物生長(zhǎng)必需的 16種營(yíng)養(yǎng)元素和某些生理活性物質(zhì) 。 I雖不是植物生長(zhǎng)所必需的，但幾乎所有組織培養(yǎng)基中都有，有些培養(yǎng)基還加入Co、 Ni、 Ti、 Be，、 Al等元素。 （ 1）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物： 一類是有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) ， 為植物細(xì)胞提供 C、 H、 O、 N等必須元素 ， 如糖類 ， AA等； 另一類是一些生理活性物質(zhì) ， 在植物代謝中起一定作用 。 （ 2）有機(jī)物質(zhì)： 主要加入植物天然的 5類激素物質(zhì)及其人工合成的類似生長(zhǎng)激素物質(zhì)。 這些物質(zhì)不是植物細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的，但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有益。液體培養(yǎng)基中加入瓊脂糖，可改善培養(yǎng)細(xì)胞的供氧狀況。 （ 5）其他對(duì)生長(zhǎng)有益的未知復(fù)合成分 光 植物細(xì)胞代謝產(chǎn)物的合成受光質(zhì)和光量的調(diào)節(jié) 。 最適生長(zhǎng)溫度 25～ 30℃ ，此外，溫度對(duì)培養(yǎng)基成分的利用速度也有一定的影響。在培養(yǎng)過(guò)程中，通常 pH作為一個(gè)重要參數(shù)被控制在一定范圍內(nèi)。 通氣 通氣是細(xì)胞液體深層培養(yǎng)重要的物理化學(xué)因子。對(duì)搖瓶試驗(yàn)，通常 500mL的三角瓶?jī)?nèi)裝 80— 200mL的植物 細(xì)胞培養(yǎng) 液較適宜。試驗(yàn)表明，從溶氧速率考慮，以棉花塞最好，微孔硅橡膠塞次之，鋁箔塞最差。 在臨界水平之上 ， 生長(zhǎng)不受溶解氧的影響 ， 根據(jù)干重或細(xì)胞數(shù)目計(jì)算的生長(zhǎng)呈指數(shù)增加 。 五、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)： 組織培養(yǎng)指以分離出的植物各部位的組織或誘導(dǎo)的愈傷組織為外植體的離體無(wú)菌培養(yǎng)。 1． 組織培養(yǎng)： 人參愈傷組織 細(xì)胞培養(yǎng)指以單個(gè)的游離細(xì)胞 (如用果酸酶從組織中分離的體細(xì)胞，或花粉細(xì)胞、卵細(xì)胞 )為接種體的離體無(wú)菌培養(yǎng)。 （ 1）花粉培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下取出花藥或從花藥中取出花粉粒（小孢子），置于人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，形成花粉胚或花粉愈傷組織，最后長(zhǎng)成花粉植株。原生質(zhì)體在良好的培養(yǎng)基上可以生長(zhǎng)與分裂，并通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)分化長(zhǎng)出莖、葉，再長(zhǎng)出根而形成植株。這些小的細(xì)胞聚合體通常來(lái)自植物的愈傷組織。 懸浮培養(yǎng) ① .半連續(xù)培養(yǎng)法：每隔一定時(shí)間（如 1～ 2天）收獲部分培養(yǎng)物，再加入等量培養(yǎng)基的方法。 固定化細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞固定化是將細(xì)胞包埋在惰性支持物的內(nèi)部或貼附在它的表面。 植物細(xì)胞工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)首先是細(xì)胞生物量的增長(zhǎng)，細(xì)胞即為重要的產(chǎn)品之一。 日本曾用煙草細(xì)胞培養(yǎng)收集煙草細(xì)胞作為煙草原料 。 初級(jí)及次級(jí)代謝物的生產(chǎn) 化合物 細(xì)胞來(lái)源 作用 紫草素 紫草細(xì)胞 抗炎劑 ， 食用色素 辣椒素 朝天椒細(xì)胞 食品 ， 化妝品色素 甘草精 甘草細(xì)胞 甜味劑 香豆素 薰衣草細(xì)胞 香料 薄荷醇 薄荷細(xì)胞 香料 黃連素 黃連細(xì)胞 止瀉藥 類胰島素 苦瓜細(xì)胞 治療糖尿病 毛地黃毒素 毛地黃細(xì)胞 強(qiáng)心藥 利血平 羅夫杉細(xì)胞 降血壓藥 奎寧堿 金雞納樹(shù) 抗瘧疾 長(zhǎng)春花堿 長(zhǎng)春花