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生物制藥技術(shù)三ppt課件-展示頁

2025-01-17 05:00本頁面
  

【正文】 要糖基化。 理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞系 動物細(xì)胞生理特點(diǎn) ( 1)分裂期長 ,細(xì)胞生長緩慢,易受微生物污 染,培養(yǎng)時(shí)需要抗生素。 ( 3) 兼性貼壁細(xì)胞 對支持物的依賴性不嚴(yán)格,既可貼壁生長, 也可懸浮生長。 ( 2)、 非 貼壁細(xì)胞 ( anchoragedindependent cell ) 生長不依賴支持物表面,在培養(yǎng)液中懸浮生長。 大多數(shù)動物細(xì)胞都屬于此類。 但細(xì)胞在離體培養(yǎng)時(shí)形態(tài)會發(fā)生變化,根據(jù)不同的需要將離體培養(yǎng)的細(xì)胞分為: 貼壁細(xì)胞 、 懸浮細(xì)胞 和 兼性貼壁細(xì)胞 。 ?多核細(xì)胞:含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。 植物細(xì)胞融合過程 人造小鼠培育過程示意圖 七、 雜種細(xì)胞的篩選 根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞中所含有核的類型,可將其分為以下幾種類型: ?異核細(xì)胞:非同源細(xì)胞的融合體。 ③ 篩選雜合細(xì)胞 將上述混合液移到特定的篩選培養(yǎng)基上,讓目的雜合細(xì)胞生長,其他細(xì)胞無法生長。動物細(xì)胞則無此障礙。 電融合的基本過程: 細(xì)胞膜的接觸: 當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí),電場通電后,電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液,其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子,從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串; 膜的擊穿: 原生質(zhì)體成串排列后,立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿,從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。 電融合法 電融合法是 80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù),在直流電脈沖的誘導(dǎo)下,細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變,使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂,進(jìn)而質(zhì)膜開始連接,直到閉和成完整的膜,形成融合體。 聚乙二醇( PEG)法 細(xì)胞融合步驟 ( 1)將兩種不同親本細(xì)胞各 5 l06混勻; ( 2)離心沉淀,吸去上清液; ( 3)加 1ml 50% PEG溶液,用吸管吹打,使之與細(xì)胞接觸 1分鐘; ( 4)加 9ml 培養(yǎng)液,離心沉淀,吸去上清液; ( 5)加 5ml 培養(yǎng)液,分別接種 5個(gè)直徑 60mm平皿,每個(gè)平皿加培養(yǎng) 液至 5ml, 37℃ 的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 ?PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn) : 其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低,勿需特殊設(shè)備;融合子產(chǎn)生的異核率較高;融合過程不受物種限制。 ?PEG溶液在 。 ?PEG經(jīng)高壓滅菌后,與溫?zé)岬?Engle氏液混合。 用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細(xì)胞融合過程示意圖 ?聚乙二醇 (PEG)結(jié)構(gòu)為: HOH2C( CH20CH2) nCH2OH,分子量大于 200小于 6000者均可用作細(xì)胞融合劑。 ? 仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段: 病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如下: ① 兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng),加入病毒,在 4℃ 條件下病毒附著在細(xì)胞膜上。 ?體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng),從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。 ?20世紀(jì) 80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。 ?1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇( PEG)化學(xué)融合法。 ?Cienkawski(1876)、 Buck(1877)、 Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。 ?Luginbuhl于 1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。 狹義: ?Muller于 1838年觀察到脊椎動的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。 第一節(jié) 細(xì)胞融合 細(xì)胞融合 ( cell fusion),又稱體細(xì)胞雜交( somatichybridiazation),是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過膜融合形成單個(gè)細(xì)胞的過程。 第三章 細(xì)胞工程制藥 細(xì)胞工程 (cell engineering)是指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論與方法,按照人們的需要和設(shè)計(jì),在細(xì)胞水平上的遺傳操作,并通過細(xì)胞融合、 核質(zhì)移植、染色體或基因移植以及組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法,快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。 1665年英國物理學(xué)家胡克用自制的顯微鏡發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞 . 胡克所用的顯微鏡及觀察的櫟樹細(xì)胞壁 1674年荷蘭科學(xué)家列文虎克才真正觀察到了細(xì)胞 細(xì)胞是一切生命活動的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。 一、細(xì)胞融合的定義 廣義: 細(xì)胞融合 是指用人工方法使兩種或兩種以上的體細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì) 胞,不經(jīng)過有性生殖過程而得到雜種細(xì)胞的方法。 ?Virchow于 1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。 ?Lange于 1875年第一個(gè)觀察到脊椎動物(蛙類)的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過程。 ?1958年日本學(xué)者岡田( Okada)發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細(xì)胞融合的效應(yīng)。 ?1975年 Kohler和 Milstein成功地融合了小鼠 B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。 二、細(xì)胞融合研究進(jìn)展 生物種類 細(xì)胞來源 成功年代 煙草兩個(gè)種間 苷藍(lán) —— 青菜 大豆 —— 馬唐草 矮牽牛 —— 龍面花 大麥 —— 花生 大麥 —— 大豆 小麥 —— 矮牽牛 油菜 —— 大豆 玉米 —— 大豆 大豆 —— 野豌豆 大麥 —— 蠶豆 大豆 —— 草香木犀 酵母菌 —— 雞 大豆 —— 煙草 大豆 —— 秋水仙 人 —— 胡蘿卜 番茄 —— 馬鈴薯 人 —— 小鼠 葉 —— 葉 葉 —— 根 愈傷組織 —— 葉 葉 —— 花瓣 種子 —— 種子 葉 —— 懸浮細(xì)胞 葉 —— 花瓣 葉 —— 懸浮細(xì)胞 葉 —— 懸浮細(xì)胞 懸浮細(xì)胞 —— 懸浮細(xì)胞 葉 —— 根 懸浮細(xì)胞 —— 葉 原生質(zhì)體 —— 血紅細(xì)胞 懸浮細(xì)胞 —— 葉 懸浮細(xì)胞 —— 葉 腹水癌細(xì)胞 —— 原生質(zhì)體 葉 —— 根尖 纖維肉瘤細(xì)胞 —— 畸胎瘤細(xì)胞 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 1972 幾種細(xì)胞融合成功的例子 植物融合細(xì)胞成長狀態(tài)對比 ,右瓶為地面融合的細(xì)胞,左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞 動物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)使用的小白鼠 三、細(xì)胞融合的意義 ?理論上說任何細(xì)胞,都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。 ?融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離 機(jī)制的限制,為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。 四、細(xì)胞融合的方法 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有 3種 :生物方法 (常用仙臺病毒 ) 化學(xué)方法 (常用聚乙二醇 ) 物理方法 (電激和激光 ) 仙臺病毒法 ① 兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近; ② 通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透,胞質(zhì)互相滲透; ③ 兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合,兩個(gè)細(xì)胞融為一體; ④ 進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑,分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。并使兩細(xì)胞相互凝聚; ② 在 37℃ 中,病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng),細(xì)胞膜受到破環(huán),此時(shí)需要 Ca2+和 Mg2+,最適 PH為 ; ③ 細(xì)胞膜連接部穿通,周邊連接部修復(fù),此時(shí)需 Ca2+和 ATP; ④ 融合成巨大細(xì)胞,仍需 ATP 。 ?PEG濃度以 W/W;如將 10克 PEG與 10mlEagLe氏液混合(假定 1ml 培養(yǎng)液為 1g重 ),即成 50% PEG溶液。 ?通常用分子量低于 1000的 PEG作融合劑最好, 50% PEG溶液能產(chǎn)生 最多雜交細(xì)胞。 聚乙二醇( PEG)法 聚乙二醇( PEG)法細(xì)胞融合過程 ?PEG的作用機(jī)理 : 由于 PEG分子具有輕微的負(fù)極性,故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成 H鍵,從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋,其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合;另外, PEG能增加類脂膜的流動性,也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。其缺點(diǎn)是融合過程繁瑣, PEG可能對細(xì)胞有毒害。 ( 6) 6— 24小時(shí)后,換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。 電融合法的優(yōu)點(diǎn): ?融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對細(xì)胞傷害??; ?裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程; ?免去 PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。 電融合誘導(dǎo)法原理示意圖 五、影響細(xì)胞融合的因素 親本細(xì)胞表面性質(zhì) 親本細(xì)胞種類 細(xì)胞融合時(shí)的溫度和運(yùn)動狀態(tài) 通氧狀態(tài) PEG 離子濃度及種類 PH值 六、細(xì)胞融合的基本操作過程 ① 制備原生質(zhì)體 由于微生物及植物細(xì)胞具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁,因此通常需用酶將其壁降解。 ② 誘導(dǎo)細(xì)胞融合 兩親本細(xì)胞 (原生質(zhì)體 )的懸浮液調(diào)至一定細(xì)胞密度,按適當(dāng)比例混合后,逐漸滴人高濃度的聚乙二醇 (PEC)等誘導(dǎo)融合,或用電激的方法促進(jìn)融合。藉此獲得具有雙親遺傳特性的雜合細(xì)胞。 ?同核細(xì)胞:兩個(gè)相同細(xì)胞的融合體。 常用的雜種細(xì)胞篩選方法: ?基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選 ?基于營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選 ?由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選 ?具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選 第二節(jié) 動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用 一、通過動物細(xì)胞培養(yǎng)可生產(chǎn)的生物制品 病毒疫苗 非抗體免疫調(diào)節(jié)劑 多肽生長因子 激素 酶 病毒殺蟲劑 腫瘤特異性抗原 單克隆抗體 細(xì)胞本身 二、 動物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn) 動物細(xì)胞的形態(tài) 動物細(xì)胞屬于真核細(xì)胞,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,分化精確,不同細(xì)胞執(zhí)行不同的功能,具有不同的形態(tài)。 ( 1)、 貼壁細(xì)胞 ( anchorageddependent
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