【正文】 ADA基因的病毒感染白細胞 ， 再將白細胞注入體內(nèi) 。 基因疫苗的生產(chǎn)方法 ? 基因疫苗又稱核酸疫苗、也稱為裸 DNA疫苗，其方法是： （ 1）將編碼某種搞原蛋白的外源基因克隆到真核質(zhì)粒之中。 （ 3）質(zhì)粒的 DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生蛋白質(zhì)成為抗原，激活動物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)。 基因疫苗的種類和特征 ? 目前，基因疫苗在治療流感病毒、乙型肝炎、結(jié)核病、瘧疾、狂犬病、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、艾滋病、干細胞淋巴瘤、腦炎病毒等等方面已經(jīng)進入研發(fā)階段。 （ 2）既能激發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，本身又具有免疫作用。 （ 2）抗原性強。 ? 基因疫苗的缺點： 急需解決的是轉(zhuǎn)基因生物安全性問題，必須保證質(zhì)粒 DNA不與宿主動物發(fā)生基因整合，以防止后代發(fā)生致畸作用和出現(xiàn)遺傳病。 ? 為此人們開始研究動物的胎兒細胞。 第二節(jié) 生物制藥技術(shù)概論 ? 一：從 DNA→mRNA→Pr ? 二：細胞破碎技術(shù) ? 三：提取技術(shù) ? 四：分離純化技術(shù) ? 五：滅菌技術(shù) ? 六：干燥技術(shù) ? 七：基因工程原理 一：從 DNA→mRNA→Pr ? 1： DNA的半保留復(fù)制 ? 2： DNA轉(zhuǎn)錄成 mRNA ? 3： mRNA逆轉(zhuǎn)錄成 DNA ? 4： mRNA轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì) ? 5：蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的加工和修飾 二：細胞破碎技術(shù) （一）物理方法 （二）化學(xué)方法 （三）新型技術(shù)和方法 （一）物理方法 1：研磨法 細胞在玻璃球、或者鋼球之間被碾碎。 3：高壓勻漿法 細胞被強近性地通過小孔而剪碎。 5：快速冰凍融化法 （二）化學(xué)方法 1：滲透沖擊法 在細胞液中加入 2倍量的純水，由于滲透作用，細胞外的水分進入細胞內(nèi)，導(dǎo)致細胞膜脹破，而將內(nèi)含物釋放出來。此外，還有鏈霉菌酶、白細胞酶 C也可用于進行酶處理。常用的洗滌劑有：（ 1）十二烷基苯磺酸鈉陰離子洗滌劑，（ 2）含有銨鹽、或者氯化十八烷基三甲基季銨鹽的陽離子洗滌劑，（ 3）脂肪醇聚氧乙烯醚的非離子型洗滌劑。 ? 萃取設(shè)備有離心萃取器。 （ 4）雙水相萃取 ? 由于生物大分子在加入有機相之后常常會失活，因此出現(xiàn)了雙水相萃取技術(shù)。這二相之間互相不溶混，同時二相中的水溶液均超過 70%。能構(gòu)成雙水相有還有聚乙二醇（ PEG）和無機鹽。另外，由于聚乙二醇（ PEG）和葡聚糖（ Dex）對蛋白質(zhì)很穩(wěn)定，即使在常溫下進行操作也不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活。所需要的壓力在 。 （二）：層析技術(shù) ? 層析技術(shù)用于目的產(chǎn)品的高效分離和純化。 1：無機基質(zhì)分離介質(zhì) ? 以多孔硅膠、可控孔徑的玻璃、氧化鋯、氧化鋁、羥基磷灰石為主要載體所制成的球形、或者無定形顆粒。 （ 2）對于多肽藥物的純化分離，為了獲得較高的分離效率。常用的親水凝膠介質(zhì)，幾乎都是二醇型化學(xué)鍵合硅膠。球形的羥基磷灰石產(chǎn)品有KOBECERAM、 HASI，片形的羥基磷灰石產(chǎn)品有中科院生化所生產(chǎn)的產(chǎn)品。 無機基質(zhì)分離具體方法 （ 1）離子交換層析，其介質(zhì)有強陽、弱陽、弱陰、強陰之分。 （ 4）疏水作用層析，用于分離親水性強有蛋白質(zhì)， （ 5）親和介質(zhì)層析，針對不同的生物大分子需要采用不同的特異性親和介質(zhì)。 （ 2） N乙烯吡啶共聚物，屬于親水性凝膠體性質(zhì)，常用的有TSKgelDEAE5PW、 TSKgelSP5PW、 TSKgelCM5PW。 ? 根據(jù)層析方法不同，又可分為： （ 1）紙層析 （ 2）薄層層析 （ 3）離子交換層析 （ 4）凝膠分子篩層析 （ 5）親和層析 （ 3）離子交換層析 ? 目前能夠在工業(yè)上加以應(yīng)用的離子交換層析設(shè)備有瑞典 Pharmacia公司生產(chǎn)的 BioPilot中試層析系統(tǒng)，其進樣量可達 10L。 ? A：離子交換劑 ? B：離子交換劑的類別 ? C：離子交換劑的處理 A：離子交換劑的性質(zhì) ? 離子交換劑是一種不溶性的固體物質(zhì)，由二部份組成： （ 1）一部份是不溶性的骨架， （ 2）另一部份是通過靜電吸引在骨架上的離子。 ? 離子交換劑的骨架由不同的材料所組成： （ 1）硅酸鋁， （ 2）多糖， （ 3）天然的聚合物。 B：離子交換劑的類別 （ 1）以聚丙乙烯及其衍生物為骨架的離子交換樹脂 如商品樹脂 Dowex（美國）、 Zerolite（英國）、 Amberlite（美國）、上海樹脂廠生產(chǎn)的 70 72 73華北制藥廠生產(chǎn)的 101樹脂。 （ 3）以葡聚糖凝膠作為骨架的離子交換樹脂 如 DEAESephadex， DEAESephadexA25。 C：離子交換劑的處理 ? 離子交換劑在使用之前必須經(jīng)過前處理，以除去雜質(zhì)、并使得交換劑充分溶脹。所用酸堿的濃度為 。 （ 2）陰離子交換劑經(jīng)過酸洗 → 水洗 → 堿洗 → 水洗的處理序。 （ 1）陽離子交換劑應(yīng)采用陰離子型緩沖液，如磷酸、乙酸、檸檬酸等等酸性緩沖液， （ 2）陰離子交換劑應(yīng)采用陽離子型緩沖液，如 Tris，胺鹽、吡啶等等。 以瓊脂糖類介質(zhì)為骨架的 Sepharose、 BioGelA。 以葡聚糖 +聚丙烯酰胺為骨架的 Sephacryl。 以聚羥甲基酰胺類為骨架的 Trisacryl。 以聚苯乙烯為骨架的 BioBeadsSX。 C：根據(jù)不同洗脫液的凝膠層析分類 ? （ 1）水相淋洗凝膠過濾層析，簡稱凝膠過濾。 ? （ 2）有機溶劑淋洗凝膠滲透層析，簡稱凝膠滲透。 （ 5）親和層析 ? 親和層析（ AFC）是針對專一性結(jié)合的生物大分子所進行的分離純化方法。 （三）：電泳技術(shù) ? 1：紙電泳 2：醋酸纖維膜電泳 3：凝膠電泳 淀粉凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳。 ? 根據(jù)電泳的操作方式不同，可將電泳分為： 1：園盤電泳， 2：平板電泳， 3：連續(xù)凝膠電泳， 4：連續(xù)流動電泳。組成新的遺傳物質(zhì)，然后轉(zhuǎn)入到宿主細胞內(nèi)繼續(xù)繁殖。 ? 如將人的生長激素基因?qū)氲酱竽c桿菌之中，在 9升的細菌培養(yǎng)液中，所能提取出的生長激素產(chǎn)量 =從 50萬頭羊腦中提取的數(shù)量。 ? 2：發(fā)現(xiàn)了 DNA連接酶 能夠?qū)嗔训?DNA修復(fù)，連接成完整的 DNA分子。 ? 4：發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)入外源基因的手段。 （二）： DNA分子的重組 （三）：基因的分離 （四）：重組體的選擇和鑒定 （五）：重組 DNA的表達 （一） ：工程載體的構(gòu)建 基因工程載體的定義 基因工程載體有四種 質(zhì)粒 科斯質(zhì)粒 噬菌體 λ 單鏈噬菌體 M13 酵母菌人工染色體 基因工程載體的定義 ? 能夠克隆外源性 DNA，并能使其在大腸桿菌中繁殖的載體稱為基因工程載體。 （ 2）很容易從細菌核酸中分離出來。 ? 質(zhì)粒上帶有抗藥性選擇標記。 ? 外源基因的插入不會破壞質(zhì)粒的復(fù)制特性。 PR啟動子 1 PL啟動子 2 BglII限制酶切割位點 EcoRI限制酶切割位點 SmaI限制酶切割位點 BamHI限制酶切割位點 SalI限制酶切割位點 PstI限制酶切割位點 HindIII限制酶切割位點，以上切割位點形成多克隆區(qū)域，可在此插入外源性目的基因。 （ 4）質(zhì)粒的分離和提純 ? A：質(zhì)粒的分離和提純的定義 ? B：質(zhì)粒的分離和提純的基本步驟 ? C：質(zhì)粒的分離和提純的方法 A：質(zhì)粒的分離和提純的定義 ? 質(zhì)粒提純就是指大量的染色體 DNA中分離和純化質(zhì)粒 DNA。 （ a）差示離心沉淀法 ? 染色體 DNA多數(shù)是纏繞在細胞溶菌物的殘渣之中，密度較大，可以采用離心法除去。 （ c）氯化銫梯度密度離心法 ? 在 DNA中加入足夠數(shù)量的嵌入染料溴乙錠，染色體DNA分子結(jié)合得多、相對密度較大，而質(zhì)粒 DNA則結(jié)合得很少、相對密度較小，經(jīng)過平衡等密度離心之后，二類 DNA分子處于不同的色帶區(qū)內(nèi)，可實現(xiàn)分離。質(zhì)粒上的克隆方法有 3種： ? A、插入失活法 ? B、定向克隆法 ? C、磷酸酯酶處理線型質(zhì)粒 DNA法 A：插入失活法 （ a） 插入失活藍白斑篩選技術(shù) 根據(jù)插入失活原理，篩選重組子。 （ b）抗藥性基因插入失活原理 ? 質(zhì)粒同時含有二個抗藥性基因，一個為青霉素抗性基因，另一個為四環(huán)素抗性基因。 ? 先將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到對青霉素敏感的大腸桿菌之中，并在培養(yǎng)基中加入青霉素，結(jié)果沒有被轉(zhuǎn)化的親本菌株死亡，存活的是轉(zhuǎn)化菌株。 ? 再將轉(zhuǎn)化菌株接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中 自體環(huán)化質(zhì)粒在四環(huán)素培養(yǎng)基上能夠正常生長 重組質(zhì)粒在四環(huán)素培養(yǎng)基上則不能生長（達不到預(yù)期目的） （ c）抗藥性基因插入失活的改進方法 ? （由于最終需要的重組質(zhì)粒在四環(huán)素培養(yǎng)基上則不能生長，因此無法直接選擇出重組工程菌） ? 在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中再加入一種親脂的螯合劑萎蔫酸（ 5丁基吡啶 2甲酸、 fusaric acid）或者喹啉 2羧酸。凡是能夠正常生長的菌株 90%以上是重組工程菌。用凝膠電泳法分離其中的大片段。 ? 質(zhì)粒 +外源性 DNA由于粘性末端互補而形成連接。結(jié)果所得到的 DNA