【正文】 細(xì)胞培養(yǎng)基并增加 TCA 循環(huán)，生物反應(yīng)器中活細(xì)胞密度最高可達(dá) 107cell/ml。 Genzyme， Geic Institute， Bayer 公司等則都采用連續(xù)灌流工藝。 目前采用動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰瘡病毒疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗、 α 及 β 干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子 Ⅷ 和 Ⅸ 、促紅細(xì)胞素、松弛素、生長激素、蛋白 C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶以及單克隆抗體等。在流加懸浮培養(yǎng)工藝方面，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國科學(xué)院化工冶金研究所生化工程國家重點實驗室、蘭州生物制品研究所致力于動物細(xì)胞流加懸浮培養(yǎng)工藝的研究與應(yīng)用。國內(nèi)未見有萬升級的生物反應(yīng)器用于生產(chǎn)的報道。 上海華東理工大學(xué)、中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所等單位也從事了連續(xù)灌注培養(yǎng)工藝的開發(fā)實踐，華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室在流加懸浮培養(yǎng)工藝方面開展了研究。 動物 細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)及其 生物反應(yīng)器工程平臺 來源：中國醫(yī)藥報 動 物細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞、 CHO細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等）大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)及其生物反應(yīng)器工程可廣泛應(yīng)用于抗體、基因重組蛋白質(zhì)藥物、病毒疫苗等生物技術(shù)產(chǎn)品的研究開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)，華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室在動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)及其生物反應(yīng)器工程研究和開發(fā)應(yīng)用方面，長期以來得到國家重大科技攻關(guān)計劃、 863計劃等的大力支持，擁有一支精干的研究開發(fā)團隊和一系列現(xiàn)代化設(shè)備儀器，建立了由無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)、培養(yǎng)過程及生物反應(yīng)器設(shè)計放大與強化技術(shù)、大規(guī)模高密 度流加和連續(xù)灌注培養(yǎng)技術(shù)、培養(yǎng)過程計算機實時監(jiān)測與控制技術(shù)、病毒類產(chǎn)品大規(guī)模高效生產(chǎn)技術(shù)等核心技術(shù)組成的大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其生物反應(yīng)器工程平臺。 動物細(xì)胞培養(yǎng)過程 及生物反應(yīng)器設(shè)計放大與強化技術(shù) 與幾何放大、因次放大等經(jīng)驗放大方法不同的是，本平臺所擁有的動物細(xì)胞培養(yǎng)過程及生物反應(yīng)器放大與強化技術(shù)是根據(jù)動物細(xì)胞大規(guī)模高密度培養(yǎng)過程的特點，在氣液傳質(zhì)和流體力學(xué)等理論的指導(dǎo)下，在認(rèn)識細(xì)胞與流體剪切力、細(xì)胞與氣泡相互作用機理的基礎(chǔ)上，其核心是采用機械攪拌和直接通氣鼓泡強化氣液傳質(zhì)能力和流體混合條件，以使培養(yǎng)過程和生物反應(yīng)器能支持108cell/ml 以上細(xì)胞密度生長的能力，同時能有效消除流體剪切和氣泡對細(xì)胞的損傷與破損作用，實現(xiàn)放大過程中強化供氧混合與防止細(xì)胞破損的統(tǒng)一，使大規(guī) 模細(xì)胞培養(yǎng)過程及其生物反應(yīng)器能夠重復(fù)實驗規(guī)模的試驗結(jié)果，從而為動物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供寬廣的放大與強化空間。 動物細(xì)胞大規(guī)模高密度流加和連續(xù)灌注培養(yǎng)技術(shù) 與已往連續(xù)流加和灌注培養(yǎng)技術(shù)不同的是，本平臺所建立的動物細(xì)胞高密度連續(xù)流加和灌注培養(yǎng)技術(shù)的特點是通過調(diào)控細(xì)胞的生理狀態(tài)和代謝網(wǎng)絡(luò)，設(shè)計優(yōu)化的培養(yǎng)基營養(yǎng)組成和流加、灌注技術(shù)，從而提高營養(yǎng)物代謝和能量利用率，降低有毒副產(chǎn)物生成，有效解決營養(yǎng)物耗竭和 有毒副產(chǎn)物積累的矛盾，這樣可在相同培養(yǎng)基流加或灌注速率的條件下細(xì)胞密度可比現(xiàn)有流加或灌注培養(yǎng)技術(shù)提高四至五倍，上清夜中目標(biāo)產(chǎn)物濃度可比傳統(tǒng)批式（ Batch）培養(yǎng)提高六至十倍以上，生產(chǎn)過程產(chǎn)率和生物反應(yīng)器生產(chǎn)能力則可同時提高數(shù)十倍，從而顯著提高細(xì)胞培養(yǎng)過程的經(jīng)濟性，徹底改變傳統(tǒng)灌注培養(yǎng)方式只提高產(chǎn)量不提高經(jīng)濟性的缺陷。在 50L 生物反應(yīng)器中批式培養(yǎng)上述細(xì)胞，其密度可達(dá) 3106 cells/mL 以上，灌注培養(yǎng)細(xì)胞密度可達(dá) 1107 cells/mL 以上，病毒滴度比傳統(tǒng)滾瓶工藝提高 2 至 3 個單位（相當(dāng)于濃度單位 2至 3個數(shù) 量級）。 培養(yǎng)過程計算機 實時監(jiān)測與控制技術(shù) 傳統(tǒng)動物細(xì)胞培養(yǎng)過程及其生物反應(yīng)器能夠進(jìn)行實時監(jiān)測和控制的參數(shù)只有溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、溶解氧濃度（ DO）和 pH等物理環(huán)境參數(shù)，而與細(xì)胞生理狀態(tài)和代謝活性相關(guān)的生理生化參數(shù)卻一概不能進(jìn)行實時檢測和控制，與此不同的是本平臺所建立的計算機實時監(jiān)測與控制技術(shù)，是利用OUR（細(xì)胞耗氧速率）與細(xì)胞生長動力學(xué)、代謝動力學(xué)參數(shù)間的關(guān)系，通過計算機在線檢測培養(yǎng)過程中 OUR 的變化，以監(jiān)測和控制培養(yǎng)過程中的細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝活性、細(xì)胞生長速率、營養(yǎng)物代謝途徑和目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)等生理生化關(guān)鍵參數(shù)，從而為動物細(xì)胞工業(yè)化培 養(yǎng)過程的自動在線監(jiān)測和控制奠定了基礎(chǔ)。 1）細(xì)胞工程中心采用正交實驗設(shè)計方法對無血清培養(yǎng)基常用的添加成分進(jìn)行篩選，確定了幾個關(guān)鍵性的血清替代成分，分別研制成功 CHO－TS2雜交瘤細(xì)胞 HAb18的無血清培養(yǎng)基 ?/p 2） 雜交瘤細(xì)胞的無血清、高密度懸浮馴化培養(yǎng)，與有血清比較細(xì)胞特異性比生長速率無改變，抗體比生成速率提高 50%。 4）建立了具有較好通用性的無血清凍存技術(shù)，凍存細(xì)胞直接用無血清培養(yǎng)基復(fù)蘇，存活率達(dá) 85%以上。該工藝采用流加一種或多種濃縮的能源物質(zhì)和氨基酸，結(jié)合灌流基礎(chǔ)培養(yǎng)基的方法。 HAb18 抗體是細(xì)胞工程中心研發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗人肝癌單抗，目前已進(jìn)入 Ⅲ 臨床實驗。其流程包括以下幾個方面： 1） HAb18細(xì)胞特異灌流控制； 2）用擴張柱床 Streamline Sp純化回收培養(yǎng)液上清 IgG； 3）用 DEAE陰離 子柱除去終產(chǎn)品中的熱源質(zhì)； 4）終產(chǎn)品質(zhì)控及凍干。應(yīng)用該生產(chǎn)工藝，培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的生長 密度達(dá) 1′107cells/mL ，抗體產(chǎn)量達(dá)到 150mg/L～ 250mg/L。 由計算機通訊接口引入生化分析儀的測量反饋信號，通過數(shù)據(jù)處理與反饋輸出，運用控制軟件實現(xiàn)靈活強大的控制算法來控制補料泵的精確調(diào)節(jié)，使生化分析儀、補料泵和生物反應(yīng)器間的閉環(huán)協(xié)同自動監(jiān)控得以實現(xiàn)，控制底物的連續(xù)流加，并成功用應(yīng)于雜交瘤細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)中，實現(xiàn)了對細(xì)胞生長環(huán)境的穩(wěn)定控制與快速調(diào)節(jié)，使培養(yǎng)工藝得到進(jìn)一步優(yōu)化。 疫苗 市場 增長的原動力，往往來自于疫苗的改良和新型疫苗的上市，特別是對人類有重大意義的新型疫苗上市將會極大地推動疫苗 市場 的發(fā)展。其中銷售額較大的分別為 流感疫苗 、肺炎結(jié)合疫苗、 乙肝疫苗 、百白破、麻腮風(fēng)、流腦、水痘、 Hib，其中 流感疫苗 及肺炎結(jié)合疫苗銷售額分別達(dá)到 20億和 15億美元。 目前治療性疫苗只有 Corixa 公司開發(fā)的Melacine黑色素瘤疫苗及 Avax技術(shù)公司治療黑素瘤的 MVax 癌癥疫苗，分別在加拿大及澳大利亞上市。筆者主要對國外近期上市的及未來幾年上市的重點預(yù)防性疫苗進(jìn)行分析。 由于葛蘭素史克、默克、賽諾菲巴斯德 、凱龍以及惠氏 5 家領(lǐng)先的公司約占了疫苗 市場 85%的份額，故此，新型疫苗的開發(fā)主要在這幾家公司進(jìn)行，其他小公司在研的優(yōu)良、前景好的疫苗品種也往往被這幾家大公司收購。從 5家大型疫苗企業(yè)的在研及最近上市的疫苗品種可以看出（見表 1），葛蘭素史克具有最豐富的在研疫苗產(chǎn)品線，處于 Ⅱ 、 Ⅲ 期臨床研究階段的品種遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他廠家。目前新產(chǎn)品的開發(fā)主要集中在肺炎鏈球菌、輪狀病毒、 HPV、HIV等重大疾病預(yù)防疫苗上。 流感疫苗 目前， 流感疫苗 的年銷售額已經(jīng)達(dá)到了 20億美元，是目前疫苗 市場 最大的品種。隨著新 流感疫苗 品種的上市及接種率的提升， 流感疫苗 市場 將會有較大的提升 空間。該疫苗開發(fā)進(jìn)展 最快的為默克及葛蘭素史克。其技術(shù)是默克在 1991 年從澳大利亞CSL公司獲得專利授權(quán)，是使用釀酒酵母表達(dá)。 葛蘭素史克預(yù)測， HPV疫苗每年銷售額將達(dá)到40 億 ～ 70億美元。我國的 HPV 疫苗研究較緩慢，還未見到進(jìn)入臨床前研究階段報道。肺炎結(jié)合疫苗已獲得美國 CDC 推薦給 2 歲以下健康兒童使用，而肺炎多糖疫苗則不建議推薦給健康兒童注射。 Prevnar為 7價結(jié)合疫苗，沒有包含發(fā)展中國家中常見的 2個血清型 ，所以在發(fā)展中國家該疫苗的保護(hù)性較差。Prevnar的結(jié)合蛋白為白喉 CRM197。葛蘭素史克開發(fā)的肺炎結(jié)合疫苗為 10價疫苗，商品名為 “Streptorix” ，預(yù)計將在 2020年上市，該疫苗的結(jié)合蛋白為嗜血桿菌 B蛋白，故對 B型流感嗜血桿菌引起的急性中耳炎有保護(hù)作用。 Prevnar已經(jīng)在我國 申請注冊，但未申請專利，而葛蘭素史克的Streptorix已經(jīng)在國內(nèi)獲得專利授權(quán)。 ACWY 流腦結(jié)合疫苗 ACWY流腦結(jié)合疫苗最早由巴斯德開發(fā)成功，并于 2020年上市，商品名為 “Menactra” 。該產(chǎn)品的臨床研究在繼續(xù)進(jìn)行，巴斯德期望將該疫苗的使用人群擴大到 1～ 10歲。葛蘭素史克也在開發(fā)4價的流腦結(jié)合疫苗，目前已經(jīng)進(jìn)入 Ⅲ 期臨床研究。 我國的流腦多糖疫苗最早由蘭州生物所上市，目前有不少公司在開發(fā) 4價多糖疫苗及 2價的結(jié)合疫苗，但是目前還沒有廠家申報 4價結(jié)合疫苗。 輪狀病毒疫苗 也是 WHO推薦的優(yōu)先發(fā)展疫苗之一。在 2020年，默克的 4價 輪狀病毒疫苗 獲得 FDA批準(zhǔn)上市，商品名為 “Rotateq” ，該疫苗為 5價人 牛重配疫苗，用于 6周以上嬰兒。 Rotateq 及 Rotarix都已經(jīng)在我國提交注冊申請。 國內(nèi) 新型疫苗研發(fā)有差距 除 流感疫苗 外，幾種重要疫苗在我國研發(fā)進(jìn)度均落后世界幾年。 到目前為止，我國雖然批準(zhǔn)上市的疫苗種類眾多，但總體水平不高，許多重大的疫苗品種開發(fā)滯后。 戊肝疫苗 北京萬泰生物是國內(nèi)最早申報戊肝疫苗的研究單位，根據(jù)研究論文顯示，該單位的戊肝疫苗生物使用大腸桿菌表達(dá)，獲得了類病毒體顆粒。另外，蘭州生物所也申報了戊肝疫苗，具體情況沒有太多文獻(xiàn)及新聞報道。葛蘭素史克使用昆蟲細(xì)胞表達(dá) 56kD 的 ORF2蛋白，獲得了類病毒體（ VLPs）。該研究單位克隆人幽門螺桿菌保護(hù)性抗原尿素酶 B亞單位（ UreB）及熱休克蛋白（ HspA）基因，將其融合構(gòu)建成以大腸桿菌不耐熱腸毒素 B亞單位（ LTB）為分子內(nèi)粘膜佐劑的胃病疫苗基因工程疫苗候選株。 在國外，幽門螺旋桿菌疫苗主要由 Acambis及 Antex兩個公司開發(fā)。 Antex 開發(fā)的疫苗是 滅活多價全細(xì)胞疫苗，商品名為 “Helivax” 。有評論說，全細(xì)胞疫苗主要是副作用較大。 SARS 疫苗 我國申報 SARS疫苗 的研究單位有北京科興等3家企業(yè)，其中北京科興研究進(jìn)展最快，該單位已經(jīng)完成 Ⅰ 期臨床研究，在 2020年召開了 Ⅱ 期臨床研究方案研討會。國外 SARS疫苗 研發(fā)單位較多，包括巴斯德等都處于臨床前階段。除 流感疫苗 外，這幾種重要疫苗在我國研發(fā)均落后世界幾年。 動物疫苗市場將進(jìn)入黃金時期 來源：新財富 動物疫苗行業(yè)長期被 市場 忽視，但隨著畜牧業(yè)的需求增長 以及寵物疫苗 市場 的開拓，這一行業(yè)的發(fā)展前景看好。我們認(rèn)為，全球動物疫苗 市場 擁有良好發(fā)展?jié)摿?。如印度政府為控制禽畜類疾病，斥資 52億盧比開展了一項名為 “ 禽畜衛(wèi)生與疾病控制 ” 的項目。第三，生物技術(shù)進(jìn)步推動。第四，食品衛(wèi)生安全要求不斷提高。第五，從效費比看，注射疫苗進(jìn)行免疫比撲殺動物花費少、節(jié)約成本，各國政府積極扶持。同時撥出 3800萬美元協(xié)助東南亞國家遏制禽流感蔓延。11” 后美國重視對生物恐怖襲擊的預(yù)防，美國政府 2020年度財政預(yù)算專門撥付約 700 萬美元資金，用以購買和儲備包括口蹄疫、高致病性 禽 流感疫苗 等在內(nèi)的獸用疫苗制品。今后幾年，國內(nèi)動物疫苗 市場 將步入快速發(fā)展的黃金時期。豬、牛、羊等主要牲畜的存欄量和出欄量基本上保持 510%的增長率，而魚蝦等水產(chǎn)品也有疫苗需求。規(guī)?；B(yǎng)殖，特別是高密度養(yǎng)殖，提高了禽畜的疫病傳染概率。例如，因為抗生素殘留超標(biāo)，歐盟自 2020年初開始全面禁止從中國進(jìn)口兔、家禽肉和蝦等動物源性食品和水 產(chǎn)品。第四，政府對動物疫情日趨重視。 2020 年，中央和地方財政投入禽流感防控的專項資金近 16億元，其中用于支付 禽 流感疫苗 補助經(jīng)費就達(dá)到 11億元； 2020年11 月，國務(wù)院從中央預(yù)算中安排了 20 億元設(shè)立“ 高致病性禽流感防控基金 ” ，各省也增加投入設(shè)立專項防控基金。首先是政策壁壘，由于疫苗直接關(guān)系到動物食品的衛(wèi)生安全，而且生產(chǎn)需要使用病毒、細(xì)菌等病原體，因此生產(chǎn)要獲得國家有關(guān)部門的批準(zhǔn)；其次是技術(shù)壁壘，疫苗制品的技術(shù)含量較高；再次是資金壁壘，要生產(chǎn)出質(zhì)量較高、附加值高的疫苗產(chǎn)品，對生產(chǎn)車間與設(shè)備的投入都很大，而且很多疫苗產(chǎn)品都需要低溫保藏，冷鏈運輸，后期的投入也較高。 寵物疫苗 市場 方興未艾 多年來，經(jīng)濟動物用疫苗約占全球獸用疫苗市場 份額的 2/3 左右，但寵物 市場 發(fā)展快速，所占 的比重越來越大（圖 2）。以美國為例， 2020 年寵物疫苗 市場 規(guī)模高達(dá)，占動物疫苗 市 場 的 45%，估計目前已經(jīng)超過 50%。從養(yǎng)寵物的數(shù)量和消費能力上看，北京、上海、廣州、重慶和武漢已經(jīng)成為中國五大 “ 寵物城市 ” ，而天津、南京、杭州、深圳、成都等城市的寵物普及程度也相當(dāng)高。目前寵物疫苗 市場 約 3 億元，但由于很多寵物并沒有按規(guī)定注射疫苗，我們估計實際 市場 空間在10 億元以上。 全球疫苗市場壟斷加劇 來源：搜狐證券