【正文】 不論厭氧或通風(fēng)發(fā)酵設(shè)備， 除了滿(mǎn)足微生物培養(yǎng)所必要的工藝要求外，還得考慮材質(zhì)的要求以及加工制造難易程度等因素。 115 發(fā)酵設(shè)備 發(fā)酵設(shè)備是發(fā)酵工廠中主要的設(shè)備，它必需具備適應(yīng) 微生物生命活動(dòng)和形成產(chǎn)物的各種條件，促進(jìn)微生物新陳代謝，使之能在低消耗下獲得較高的產(chǎn)量 。 混菌發(fā)酵的 菌種和數(shù)量大都是未知 的，必須通過(guò)培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件控制才能順利進(jìn)行。 間歇添加法 連續(xù)流加法 恒速流加 (constantflow rate) 指數(shù)流加 (exponentialflow rate) ◇ 恒速流加操作的 補(bǔ)料速度是定值 ，操作簡(jiǎn)便，設(shè)備簡(jiǎn)單； 最常用； ◇ 發(fā)酵液體積呈線性增長(zhǎng) ；由于在指數(shù)生長(zhǎng)期，微生物的底物消耗也呈指數(shù)增加，恒速流加不能維持底物濃度不變，底物濃度會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。 采用補(bǔ)料的方法可將這些物質(zhì)保持在低濃度水平，有助于提高產(chǎn)物的生產(chǎn)。 補(bǔ)料分批培養(yǎng)應(yīng)用 111 以某些很容易被微生物利用的物質(zhì)（如葡萄糖）作為碳源時(shí)，其某些分解代謝物會(huì)使細(xì)胞某些酶的合成受到阻遏； 采用補(bǔ)料的手段 將葡萄糖逐漸加入反應(yīng)器中，使發(fā)酵液中的葡萄糖保持在低水平，避免分解代謝物的積累，從而可以有效去阻遏。 110 1）細(xì)胞的高密度培養(yǎng) ? 一般培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度有一定的限度，過(guò)高的底物濃度會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)； ? 采用補(bǔ)料的方法將高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸加入反應(yīng)器，可使發(fā)酵液中的菌體濃度達(dá)到很高的程度，如 大腸桿菌濃度可達(dá) 145g/L。 缺點(diǎn)： (1)由于沒(méi)有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導(dǎo)致比生產(chǎn)速率的下降。 (2)延長(zhǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間。 ： 根據(jù)菌體生長(zhǎng)和初始培養(yǎng)基的特點(diǎn)，在分批培養(yǎng)的某些階段 適當(dāng)補(bǔ)加培養(yǎng)基 ，使菌體或其代謝產(chǎn)物的 生產(chǎn)時(shí)間延長(zhǎng) 。 b、 黏性絲狀菌 容易附著在器壁上生長(zhǎng)和在發(fā)酵液內(nèi)結(jié)成團(tuán)，給連續(xù)發(fā)酵操作帶來(lái)困難。 據(jù)級(jí)數(shù) 單級(jí)連續(xù) 發(fā)酵 多級(jí)連續(xù) 發(fā)酵 106 連續(xù)培養(yǎng) 的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) : 1）可以保持恒定的操作條件，有利于微生物的生長(zhǎng)代謝，從而使 產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量保持穩(wěn)定 ； 2）省去了反復(fù)放料、清洗、裝料、滅菌等步驟，避免了延遲期， 提高設(shè)備的利用率和單位時(shí)間產(chǎn)量 ； 3）發(fā)酵中各參數(shù)趨于恒值， 便于自動(dòng)控制 ； 4） 易于分期控制 ，可以在不同罐中控制不同的條件； 5）大規(guī)模的分批發(fā)酵，需要大型的后處理設(shè)備，而連續(xù)發(fā)酵中，一次收獲只獲得少量發(fā)酵液，下游所需的 設(shè)備規(guī)模也可相應(yīng)減少 。根據(jù)這一特點(diǎn)，靠采用二級(jí)連續(xù)培養(yǎng)。 多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)特別適用于細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的最佳條件不同的情況。 恒濁連續(xù)發(fā)酵中， 不斷調(diào)節(jié)流入和流出的速度， 保持培養(yǎng)液中的 濁度基本不變 。在恒定的狀態(tài)下，微生物所處的環(huán)境條件如營(yíng)養(yǎng)濃度、產(chǎn)物濃度、 pH、微生物細(xì)胞的濃度以及生長(zhǎng)速率等可以始終維持不變 。 2. 特點(diǎn)： 連續(xù)發(fā)酵可使發(fā)酵罐內(nèi)的 液量維持恒定 ，微生物在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)。 但由于操作相對(duì)較易，目前仍是發(fā)酵工業(yè)的主要方式。 缺點(diǎn) : 產(chǎn)率低。 所有的發(fā)酵產(chǎn)品必須在進(jìn)入死亡期以前結(jié)束發(fā)酵 。 一般總菌數(shù)不變 ,活菌數(shù)曲線下降 。 穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達(dá)到最高 。 100 靜止期 ： 活菌數(shù)目不增不減，生長(zhǎng)速率趨于 0,曲線有一下降的趨勢(shì)。 99 減速期 隨著 營(yíng)養(yǎng)成分的減少、有害代謝產(chǎn)物的積累 ， 生長(zhǎng)速度明顯放慢 。生長(zhǎng)速率高，代時(shí)穩(wěn)定。 98 對(duì)數(shù)期 1. 現(xiàn)象： 又稱(chēng)指數(shù)期，生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)增加，其對(duì)數(shù)與時(shí)間呈直線關(guān)系。 97 加速期 在延滯期后對(duì)數(shù)期前， 細(xì)胞生長(zhǎng)速率逐漸加快 ，進(jìn)入短的加速期。 96 ： 與菌種遺傳特性、菌齡、接種量、培養(yǎng)條件有關(guān)。 ? ： 由于細(xì)胞進(jìn)入新環(huán)境 ,細(xì)胞數(shù)目無(wú)增長(zhǎng) ，甚至有所下降有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程 ， 進(jìn)行大量的酶的生成 。 95 停滯期 ?A 現(xiàn)象： 剛接種后一段時(shí)間 ， 細(xì)胞數(shù)目和菌量不變 ，曲線平行于橫軸 。 ： （ 1）整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)與外界沒(méi)有其它物質(zhì)交換； （ 2） 整個(gè)過(guò)程中菌的濃度、營(yíng)養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度不斷變化，是一種非穩(wěn)態(tài)的培養(yǎng)方法。 不同的發(fā)酵技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，了解生產(chǎn)菌在不同的發(fā)酵培養(yǎng)方法下細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝和產(chǎn)物的變化規(guī)律，有助于發(fā)酵生產(chǎn)的有效控制。 發(fā)酵初期發(fā)現(xiàn)感染噬菌體 ，可以利用噬菌體只能在生長(zhǎng)階段的細(xì)胞中繁殖的特點(diǎn)，將發(fā)酵正常并已培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的發(fā)酵液加入感染噬菌體的發(fā)酵液中，以等體積混合后再發(fā)酵。 種子擴(kuò)大培養(yǎng) 過(guò)程中發(fā)現(xiàn)污染就應(yīng) 放棄種子 ； 90 發(fā)酵早期 發(fā)現(xiàn)染菌時(shí)，可采用 接入大量種子，使生產(chǎn)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì) ，抵制雜菌的繁殖；或立即將發(fā)酵液滅菌重新接種； 發(fā)酵后期 染菌，而雜菌又不影響生產(chǎn)菌的正常發(fā)酵，也不妨礙產(chǎn)品后處理，則讓其共生長(zhǎng)；如果 雜菌影響發(fā)酵的正常進(jìn)行或產(chǎn)品的后處理，應(yīng)提前放罐 ；還可以在發(fā)酵液中加入抑制雜菌的物質(zhì)。 發(fā)酵過(guò)程中要注意以下事項(xiàng)： A、嚴(yán)禁活菌體排放； B、建立經(jīng)常性的環(huán)境衛(wèi)生制度； C、把握種子關(guān)，嚴(yán)防噬菌體進(jìn)入種子罐和發(fā)酵罐； 89 D、合理布置車(chē)間； E、利用藥物防治。 污染的防治 a、防止種子帶入雜菌； 88 b、培養(yǎng)基的徹底滅菌； c、防止空氣系統(tǒng)染菌； d、注意環(huán)境衛(wèi)生，建立衛(wèi)生制度。 b、載玻片法 ：將被檢查樣品和菌液與含有 ％瓊脂的培養(yǎng)基混合，涂于無(wú)菌載玻片上，凝固后，經(jīng)數(shù)小時(shí)培養(yǎng)，在顯微鏡下放大觀察噬菌體是否存在。 顯微鏡下發(fā)現(xiàn)菌體數(shù)量顯著減少，形態(tài)變粗 86 染色不均勻，細(xì)胞壁不整齊，菌體逐漸裂解后出現(xiàn)碎片， 發(fā)酵液發(fā)黏，完整菌體很少 ，這時(shí)懷疑有噬菌體污染。 如谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中的種子或發(fā)酵罐污染噬菌體一般都在對(duì)數(shù)期。 發(fā)酵目的產(chǎn)物的測(cè)定 如發(fā)酵目的物已不再上升，結(jié)合碳源已接近耗盡，菌體衰老自溶，溫度不在上升，就 可以停止發(fā)酵 。 84 糖測(cè)定方法有 物理法和化學(xué)法 。糖消耗越快，說(shuō)明生長(zhǎng)越旺盛，但只有糖份下降，而無(wú)發(fā)酵產(chǎn)物的增加，應(yīng)該考慮是否有雜菌污染 。 無(wú)菌檢查 為及時(shí)發(fā)現(xiàn)雜菌，以便采取有效的措施，對(duì)每次無(wú)菌取樣的發(fā)酵液必須進(jìn)行無(wú)菌檢查。 用顯微鏡檢查 各個(gè)發(fā)酵階段的菌體形態(tài) ，同時(shí)對(duì)菌體的生長(zhǎng)情況進(jìn)行吸光度測(cè)定。 ?缺點(diǎn)： 不能從根本上消除引起泡沫穩(wěn)定的原因。 機(jī)械消泡是依靠物理學(xué)原理， 即通過(guò)機(jī)械力引起強(qiáng)烈振動(dòng)或壓力變化，使泡沫破裂。純聚二甲基硅氧烷的消泡能力低，常加分散劑來(lái)提高消泡活性。 ?②高碳醇、脂肪酸和酯類(lèi)： 十八醇是常用的一種，它可以單獨(dú)或與載體一起使用。 當(dāng)泡沫的液膜具有較大的表面黏度時(shí)，可以加入某些分子內(nèi)聚力較小的物質(zhì)，以降低液膜黏度。 2） 降低液膜的表面黏度，使液膜的液體流失，導(dǎo)致泡沫破裂。 對(duì)于已形成的泡沫，工業(yè)上可以采用 機(jī)械消泡和化學(xué)消泡劑消泡 或兩者同時(shí)使用消泡。 78 ② 采用 機(jī)械消泡或消泡劑消泡 這兩種方法來(lái)消除已形成的泡沫： 通過(guò)化學(xué)方法，降低泡沫液膜的表面張力，使泡沫破滅 ；利用物理方法， 使泡沫液膜的局部受力，打破液膜原來(lái)受力平衡而破裂 。 77 泡沫的控制 泡沫的控制，可以采用三種途徑： ① 調(diào)整培養(yǎng)基中的成分 (如少加或緩加易起泡的原材料 )或 改變某些物理化學(xué)參數(shù) (如 pH值、溫度、通氣和攪拌 )或者 改變發(fā)酵工藝 (如采用分次投料 )來(lái)控制 ，以減少泡沫形成的機(jī)會(huì)。 但也給發(fā)酵帶來(lái) 不利 的影響。 代謝產(chǎn)生的氣體 也能產(chǎn)生泡沫。 75 發(fā)酵過(guò)程中泡沫的影響和控制 微生物在深層培養(yǎng)過(guò)程中由于 通風(fēng)和攪拌、代謝氣體的逸出以及培養(yǎng)基中糖、蛋白質(zhì)、代謝物等穩(wěn)定泡沫的活性物質(zhì) 存在，使發(fā)酵液中產(chǎn)生大量的泡沫。 通過(guò)中間補(bǔ)料控制 pH。 緩沖液的利用。 生理酸性和生理堿性物質(zhì)的利用。 74 在發(fā)酵過(guò)程中使 pH穩(wěn)定在最適合的范圍的方法 在設(shè)計(jì)培養(yǎng)基時(shí)考慮到維持 pH的需要。 同樣的方法可測(cè)得 產(chǎn)物合成的最適 pH值 。 pH值對(duì)發(fā)酵的影響 73 發(fā)酵過(guò)程中 pH值的調(diào)節(jié)及控制 最適 pH值的確定： 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 不同的 pH值出發(fā)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中定時(shí)測(cè)定和調(diào)節(jié) pH值以維持出發(fā) pH值，或者利用緩沖液配制培養(yǎng)基來(lái)維持。 發(fā)酵： pH 。 69 不同種類(lèi)微生物，對(duì) pH要求不同； 酵 母： pH － 細(xì) 菌： pH － 霉 菌： pH － 放線菌： pH － PH的影響及控制 PH的影響 70 pH不同，微生物 代謝產(chǎn)物不同 黑曲霉 pH： 2－ 3，檸檬酸發(fā)酵 pH： ，草酸發(fā)酵 谷氨酸菌 pH： 7－ 8， 谷氨酸 發(fā)酵 pH： － ，谷氨酰胺發(fā)酵 釀酒酵母 pH： ，乙醇發(fā)酵 pH： ，甘油發(fā)酵 71 微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵的最適宜 pH可能不同。 b、培養(yǎng)基的成分和濃度顯著影響耗氧： 培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)豐富，菌體生長(zhǎng)快，耗氧量大；發(fā)酵液濃度高，耗氧量大；發(fā)酵過(guò)程補(bǔ)料或補(bǔ)糖，微生物對(duì)氧的攝取量隨著增大。 c、 調(diào)節(jié)通風(fēng)速率； d、 調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速。因此控制溶解氧濃度應(yīng)從供氧和需氧兩個(gè)方面考慮。 67 溶解氧濃度的控制 發(fā)酵液的溶解氧濃度是由 供氧和需氧 兩方面決定的。 66 發(fā)酵工藝中引起 溶解氧異常下降的原因 有： 污染好氣性雜菌 ，大量的溶解氧被消耗掉，可能使溶解氧短時(shí)間內(nèi)降到零附近，如果雜菌本身好養(yǎng)量不強(qiáng)，溶解氧變化可能也不明顯； 菌體代謝發(fā)生異常現(xiàn)象 ，