生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)(參考版)
2025-07-20 20:52本頁(yè)面
【正文】 。 1）每 ml肝勻漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位（ U/ml） 試管 試劑 ( m l ) 測(cè)定管 （ A ） 標(biāo)準(zhǔn)管 （ S ） 對(duì)照管 （ B ） 空白管 谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物 —— —— 37 ℃ 水浴 5 分鐘 肝勻漿 （標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸） （ H2O ） 混勻后 37 ℃ 水浴 準(zhǔn)確 保溫 30 分鐘 二硝基苯肼 谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物 —— —— 混勻后 37 ℃水浴 準(zhǔn)確保溫 20 分鐘 N a O H 各加 5m l ，混勻，靜置 10 m i n ，讀 A 52 0nm A 52 0nm 2）每 g 肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位（ U/g） D’ = D 200 / 20 說(shuō)明： A：樣品 A 520nm B：對(duì)照 A 520nm S：標(biāo)準(zhǔn) A 520nm 500：標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸濃度 ：谷丙轉(zhuǎn)氨酶換算單位系數(shù) 200： 200ml肝勻漿 20： 20g肝 ? ? ? ?S2 0 0BA5 0 0BAD ???????【 附注 】 2,4二硝基苯肼與丙酮酸的顏色反并不是特異性意 的， α酮戌二酸也能與 2,4二硝基苯肼作用而顯 色。 丙酮酸二硝基苯腙紅棕色2 , 4 二硝基苯肼C O O HCH2CH2C OC O O HC O O HCH2CH2C H N H2C O O HCH3C H N H2C O O HG P TCH3C OC O O HCH3C N NHNO2NO2H2OOHH2N HNNO2NO2C O O H【 實(shí)驗(yàn)試劑與器材 】 標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸 （現(xiàn)配） 谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物 4℃ ， 1周 PB % 2,4二硝基苯肼溶液 NaOH 新鮮肝臟（購(gòu)買或取活的小白鼠肝臟） 剪刀 或 組織搗碎機(jī) 37℃ 水浴 分光光度計(jì)（ 520nm） 比色皿 1計(jì)算紙（ 9 cm 9 cm） 【 實(shí)驗(yàn)步驟 】 處理： 20g 肝先用生理鹽水洗凈，濾紙吸干水，再用預(yù)冷的 PB搗碎，并定容至 200ml，供全班用。 【 實(shí)驗(yàn)原理 】 谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用于丙氨酸及 α酮戊二酸，生成谷氨酸與丙酮酸。 【 思考題 】 ？ 。 （三）準(zhǔn)確稱重，計(jì)算含量和得率。最后用乙醚洗沉淀 2次，抽干。 30mL乙醇，攪拌片刻，將全部懸濁液轉(zhuǎn) 移至布氏漏斗中抽濾。棄去清液，得酪蛋白粗制品。 將上述懸浮液冷卻至室溫。 【 實(shí)驗(yàn)試劑與器材 】 新鮮牛奶 95%乙醇 無(wú)水乙醚 —— 醋酸鈉緩沖液 乙醇 —— 乙醚混合液：乙醇 ∶ 乙醚 =1 ∶ 1（ V/V） 離心機(jī) 抽濾裝置 精密 pH試紙或酸度計(jì) 電爐 溫度計(jì) 【 實(shí)驗(yàn)步驟 】 （一）酪蛋白的粗提 100mL牛奶加熱至 40℃ 。 利用等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理 ， 將牛乳的 pH調(diào)至 ， 酪蛋白就沉淀出來(lái) 。 【 實(shí)驗(yàn)原理 】 牛乳中的主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白 ， 含量約為35g/L。 實(shí)驗(yàn)十一 酪蛋白的制備 【 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?】 學(xué)習(xí)從牛奶中制備酪蛋白的原理和方法。 固定與干燥 將顯色后的凝膠板浸于 2%醋酸溶液中， 2h后取出， 用一干凈濾紙覆蓋凝膠板上， 50℃ 烘 ~2h，烘干后，取去濾紙，背景即透明。取此溶化的凝膠 ，立即澆在電泳完畢的凝膠板上， 37℃ 避光保溫 1h，即顯示出五條深淺不等的藍(lán)紫色區(qū)帶。電泳 40~60min，電壓約100伏。凝膠凝固后，于此凝膠板一端 1/3處，用小刀開(kāi)一狹長(zhǎng)小槽，用濾紙片仔細(xì)吸去小槽內(nèi)液體。 【 實(shí)驗(yàn)試劑與器材 】 巴比妥 — HCl緩沖液（ ， ） 同工酶的蛋白結(jié)構(gòu)既有差別，它們的理化性質(zhì)也就有所差異，因此可用電泳或其他方法將它們分離開(kāi)來(lái)。 【 思考題 】 為什么說(shuō)脂肪酸 β氧化實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是制備新鮮的肝糜 ? 什么叫酮體 ?為什么正常代謝時(shí)產(chǎn)生的酮體量很少 ? 實(shí)驗(yàn)十 瓊脂糖膠電泳法分離乳酸脫氫同工酶 【 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?】 學(xué)習(xí)和掌握瓊脂糖凝膠電泳法分離乳酸脫氫酶同工酶的原理和方法。 【 注意事項(xiàng) 】 用新鮮肝糜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確保肝內(nèi)酶活力。 計(jì)算 肝臟的丙酮含量（ mmol/g） =（ V對(duì)照 V樣品） CNa2S2O3247。 酮體生成和沉淀蛋白質(zhì) 取 50ml錐形瓶 2只，編號(hào)，并按下表操作。 （ 2）稱取肝組織 5g置研缽中，加少量 %NaCl溶液，研磨成細(xì)漿。 NaIO+NaI+2HCl→I 2+2NaCI+H2O I2+2Na2S2O3→Na 2S4O6+2NaI 根據(jù)滴定樣品與滴定對(duì)照所消耗的硫代硫酸鈉之差，可以計(jì)算由丁酸氧化生成丙酮的量。在堿性的條件下，丙酮與碘生成碘仿。在正常情況下，其產(chǎn)量甚微；患 糖尿病或食用高脂肪膳食時(shí)，血中酮體含量增高，尿中也能出現(xiàn)酮體。乙酰乙酸、 β羥丁酸和丙酮總稱為酮體。兩分子乙酰輔酶 A可再縮合成乙酰乙酸。 （ 2）通過(guò)測(cè)定和計(jì)算反應(yīng)液內(nèi)丁酸氧化生成丙酮的 量，掌握測(cè)定 β氧化的方法及原理。 【 思考題 】 試述本實(shí)驗(yàn)介紹的 2， 6二氯酚靛酚滴定法的優(yōu)缺點(diǎn)。 T=1ml染料能氧化抗壞血酸 mg數(shù)。 (2)樣液滴定： 準(zhǔn)確吸取濾液兩份，每份 10． 0 m1分別放人二個(gè) l00 m1錐形瓶?jī)?nèi)，滴定方法同前。 2．滴定 (1)標(biāo)準(zhǔn)液滴定：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液 1． 0ml(含0． 1mg抗壞血酸 )置 100 ml錐形瓶中，加 9ml1%草酸，微量摘定管以 0． 1％ 2， 6— 二氯酚靛酚滴定至淡紅色，并保持 15秒鐘即為終點(diǎn)。靜置 10分鐘，過(guò)濾 (最初數(shù) m L濾液棄去 )。然后稱取 20． 0g，加 2％草酸 100m1置組織攪碎機(jī)中打成漿狀。最后用 1％ ECt溶液稀釋到刻度并混勻，靜置 10分鐘，過(guò)濾，濾液備用。放置片刻，將提取液轉(zhuǎn)入 50 m1容量瓶中。 【 實(shí)驗(yàn)步驟 】 1．不同樣品用不同方法提取 (1)松針：水洗凈，用濾紙吸去表面水分。 5． ％ 2,6— 二氯酚靛酚溶液。 3．標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液。 【 實(shí)驗(yàn)試劑與器材 】 1． 2％草酸溶液：草酸 2g，溶于 100m1蒸餾水。當(dāng)抗壞血酸全部被氧化后，稍多加一些染料，使墑定液呈談紅色，即為終點(diǎn)。在酸性溶液中， 2， 6— 二氯酚靛酚呈紅色，被還 原后變?yōu)闊o(wú)色。 【 實(shí)驗(yàn)原理 】 維生素 C是人類營(yíng)養(yǎng)中最重要的維生素之一，缺乏 時(shí)會(huì)產(chǎn)生壞血病，因此又稱為抗壞血酸。 【 思考題 】 1. 什么是酶的最適溫度？有何實(shí)踐意義？ 2. 什么是酶的最適 pH？它是否是
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