【正文】 （ 2）取 13支試管，按下表編號(hào)并添加各種試劑（ mL）。 /mL溶液的 A595約為 。 （ 4）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，用吸光度值 A595為縱坐標(biāo)作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 – 三、試劑與器材 – 1. 試劑： – （ 1） – （ 2）染料試劑： ∕mL 考馬斯亮蘭 G250 – 2. 器材： – （ 1）可見光分光光度計(jì) – （ 2）離心機(jī) （ 3）加完試劑后混勻。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要 5分鐘左右。 ? Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：（ 1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比 Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá) 1g/mL。染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。 級(jí)分 記錄體積 校正體積 蛋白質(zhì)(mg/mL) 總蛋白 活力 總活力Units 比活力 純化倍數(shù) 回收率 I 100 Ⅱ III 表 2 酶的純化表 表 3 記錄體積的校正 級(jí)分 記錄體積 核正體積計(jì)算 取樣體積 校正后體積 I 15 15 Ⅱ （ 15/） III 3 3 (15/) (12) 0 實(shí)驗(yàn)十二 Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 ? 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 了解各種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)，掌握 Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理及方法。 ? 2. 原始酶液的酶活力 E = (平均 E’ /2)稀釋倍數(shù)（ Units / mL原始組分） ? ［注］：一個(gè)酶活力單位 Units，是在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘能催化1mole蔗糖水解所需的酶量，而水解 1mole蔗糖則生成 2moles還原糖，計(jì)算時(shí)請(qǐng)注意。 ? 2. 按下頁“表 1”的順序在試管中加入各試劑（ mL），進(jìn)行測(cè)定。 3. 移液管： 、 、 4. 水浴鍋 5. 電爐 6. 橡皮筋 7. 保鮮膜 ?四、操作方法 ? 級(jí)分 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 酶活力的測(cè)定： ? 1. 用蒸餾水稀釋各級(jí)分酶液（約 5,000倍。 ? 6. ， ， 200mL。 （ 2）操作溶液：用移液管取貯液 10mL，置于50mL容量瓶中，以用 %苯甲酸或去離子水稀釋至刻度（濃度為2mmol/L）。 ? 3. %苯甲酸 200mL，配葡萄糖用，防止時(shí)間長(zhǎng)溶液長(zhǎng)菌，也可以用去離子水代替。 ? 三、試劑和器材 ? （一）試劑： ? 1. 堿性銅試劑：稱 10g無水 NaCO3，加入 100mL去離子水溶解，另稱，用 100mL去離子水溶解，混合二溶液，再加入 晶 CuSO4，溶解后定容到 250mL。其原理是在酸性條件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。 ? 二、實(shí)驗(yàn)原理 ? 為了評(píng)價(jià)酶的純化效果，必須測(cè)定各級(jí)分酶的活性和比活性。 實(shí)驗(yàn)十一 :蔗糖酶活力的測(cè)定 ? 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 掌握蔗糖酶活性測(cè)定方法。于 4℃ ， 10,000rpm，離心 10min，傾去上清，并滴干。取出 ，冷凍保存。（ 4）取出離心管，于冰浴中迅速冷卻，平衡后 4℃ ， 10,000rpm，離心 10min。 2. 熱處理 （ 1）預(yù)先將恒溫水浴調(diào)到 50℃ ，（ 2）用廣泛 pH試紙檢查清液（“粗級(jí)分 I”）的pH，用 1N乙酸將 pH調(diào)至 。（ 7）將清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積（“粗級(jí)分 I”），取出 離心管中，冷凍保存，備下次實(shí)驗(yàn)測(cè)定酶活力及蛋白質(zhì)含量。用滴管吸出上層有機(jī)相。（ 5）將混合物轉(zhuǎn)入 4個(gè)離心管中（每組 2個(gè)），平衡后，用高速冷凍離心機(jī)離心（ 4℃ ， 10,000rpm， 10min）。 （ 4）緩慢加入預(yù)冷的 30mL去離子水，每次加 2mL左右，邊加邊研磨 30分鐘。（ 2）取 5g二氧化硅放入研缽中研細(xì)。盡管這兩種酶在組成上有較大的差別，但其底物專一性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)仍十分相似，因此，本實(shí)驗(yàn)未區(qū)分內(nèi)酶與外酶，而且由于內(nèi)酶含量很少，極難提取，本實(shí)驗(yàn)提取純化的主要是外酶。在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)中的稱之為內(nèi)蔗糖酶（ internal yeast invertase），含有少量的糖。 本實(shí)驗(yàn)提取啤酒酵母中的蔗糖酶。 二、實(shí)驗(yàn)原理： 蔗糖酶（ invertase）（ D呋喃果糖苷果糖水解（ fructofuranoside fructohydrolase）（ ）特異地催化非還原糖中的 — 呋喃果糖苷鍵水解，具有相對(duì)專一性。 ? 樣品完全按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件操作，根據(jù)紫外檢測(cè)獲得的洗脫體積，從分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的分子量。當(dāng)檔位置于 調(diào) A數(shù)顯為 0 ②記錄儀：設(shè)置紙速2cm/h ③部分收集器：設(shè)置每 10min收集 1管，調(diào)恒流泵流速使每管收集液體為 4ml 即 v=五、結(jié)果計(jì)算 ? 以管號(hào)（或洗脫液體積）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)管的 A280為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。 ? 4. 上樣與洗脫：加樣前檢查床面是否平整，若不平衡用玻璃棒攪拌凝膠使其自然下沉，在膠面上放置圓形濾紙片防止加樣時(shí)沖擊床面，用膠頭滴管吸去上層多余水，然后慢慢滴加 10d牛血清蛋白樣品（每組 8人加 1次樣，兩次加樣間隔 20min），待樣品進(jìn)入凝膠后，向床面滴加2cm高度水防止干膠，擰緊螺絲；打開恒流泵，紫外檢測(cè)儀，記錄儀及部分收集記下初始筆尖位置，直至峰值出現(xiàn)記錄筆移動(dòng)距離 {L}。 三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑 ： （ 1）凝膠層析儀 （ 2）電子天平 （ 3）層析柱 ： （ 1） Sephadex G— 100 （ 2）牛血清白蛋白 （ 3）細(xì)胞色素 C （ 4）血紅蛋白 （ 5）核糖核酸酶 ? 四、操作步驟 ? 凝膠的選擇與處理：稱取凝膠干粉加過量水浸泡過夜，棄去上層細(xì) 小顆?；靹蚝笱b柱 ? 2. 裝柱：將柱子垂直固定在鐵架上，先向主內(nèi)加入四分之一柱長(zhǎng)水，再將凝膠倒入柱內(nèi)，打開下端開口，繼續(xù)灌入凝膠，直至床面距上端5cm左右，觀察柱內(nèi)凝膠是否均勻，有無氣泡及斷層出現(xiàn)。由于凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，當(dāng)混合液通過凝膠顆?？p隙中時(shí)，溶液中的溶質(zhì)凡是比網(wǎng)孔小的分子，都能自由進(jìn)入顆粒內(nèi)部而受阻滯 ,流速緩慢 ,流程長(zhǎng)而后被洗脫；而比網(wǎng)孔大的分子則不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙先被洗脫 (阻力小 ,流程短 ,流速大 )。 二、實(shí)驗(yàn)原理 凝膠層析又稱分子篩層析，是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠，對(duì)混合物中各組分按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)。 三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑 1．主要儀器： ? （ 1）分光光度計(jì) ? （ 2）離心機(jī) ? （ 3）電子天平 2．試劑： ? （ 1）茚三酮試劑 ? （ 2） 2％碳酸鈉溶液 ? （ 3） 4％碳酸鈉溶液 ? （ 4） ? （ 5） 95%乙醇 四、實(shí)驗(yàn)步驟 ? （每 2組 4人做 1標(biāo)準(zhǔn)曲線） 編號(hào) 1 2 3 4 5 6 （ ml） 0 蒸餾水（ ml） 0 4%Na2CO3（ ml） 茚三酮試劑（ ml） 2 2 2 2 2 2 800C水浴保溫 30min后冷卻至室溫 95%乙醇（ ml） 5 5 5 5 5 5 蒸餾水（ ml） 5 5 5 5 5 5 A515nm 以亮氨酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，以 A515縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ? 樣品的處理與測(cè)定：在電子天平上稱取小麥粉 10mg于具塞試管底部 →加 1ml 2% 碳酸鈉于 80℃ 水浴中保溫提取10min→加 2ml茚三銅試劑 80℃ 水浴中保溫 30min后冷卻至室溫 →加 5ml 95%乙醇和 5ml蒸餾水充分混勻后轉(zhuǎn)移至離心管中 3000轉(zhuǎn) /分 離心 3min（離心前必須平衡） →取上清液測(cè)A（以 1號(hào)管調(diào)零） 五、結(jié)果計(jì)算 ? 賴氨酸含量（ %）＝ ? 式中： m：標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的