【正文】 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 生物技術(shù)系 Henan University of Technology 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1. 淀粉含量測(cè)定 2. 氨基酸的紙上層析 3. 蛋白質(zhì)分子量測(cè)定 4. 淀粉酶活力測(cè)定 5. 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 6. 甲醛滴定測(cè)氨基氮 7. 酵母 RNA的提取、組分鑒定和含量測(cè)定 8. 賴氨酸含量測(cè)定 9. 凝膠層析法分離蛋白質(zhì) 10. 蔗糖酶的提取與部分純化 11. 蔗糖酶活力的測(cè)定 12. Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 教學(xué)目的 生物化學(xué)是專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課 ， 其先修課程為無機(jī)化學(xué) 、 分析化學(xué)和有機(jī)化學(xué) 。 其目的是：學(xué)習(xí)和掌握生物技術(shù) ， 培養(yǎng)動(dòng)手觀察和思維能力 。 學(xué)習(xí)方法 預(yù)習(xí)：實(shí)驗(yàn)前必須進(jìn)行充分的預(yù)習(xí)和準(zhǔn)備 ， 并寫出預(yù)習(xí)報(bào)告 ， 做到心中有數(shù) ， 這是做好實(shí)驗(yàn)的前提 。 操作：應(yīng)按擬定的實(shí)驗(yàn)操作計(jì)劃與方案進(jìn)行 。 做到輕 （ 動(dòng)作輕 、 講話輕 ） ， 細(xì) （ 細(xì)心觀察 、 細(xì)致操作 ） ， 準(zhǔn) （ 試劑用量準(zhǔn)確 、 結(jié)果及其記錄準(zhǔn)確 ） ， 潔 （ 使用的儀器清潔 ， 實(shí)驗(yàn)桌面整潔 ， 實(shí)驗(yàn)結(jié)束把實(shí)驗(yàn)室打掃清潔 ） 。 在實(shí)驗(yàn)全過程中 ， 應(yīng)集中注意力 ， 獨(dú)立思考解決問題 。 自己難以解釋時(shí)可請(qǐng)老師解答 。 寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告：做完實(shí)驗(yàn)后 ， 應(yīng)解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象 ， 并作出結(jié)論 ， 或根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和處理 。 主要包括： a、 目的 ， b、 原理 ， c、 操作步驟及實(shí)驗(yàn)性質(zhì) 、 現(xiàn)象 ， d、 數(shù)據(jù)處理 （ 含誤差原因及分析 ） ， e、 討論 ， f、思考題回答 。 實(shí)驗(yàn)室守則 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室守則是學(xué)生實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行的保證，學(xué)生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須遵守以下規(guī)則： 1. 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，須遵守實(shí)驗(yàn)室紀(jì)律和制度，聽從老師指導(dǎo) 2. 未穿實(shí)驗(yàn)服、未寫實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告者不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 3. 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，要熟悉周圍環(huán)境，熟悉防火及急救設(shè)備器材的使用方法和存放位置，遵守安全規(guī)則。 4. 實(shí)驗(yàn)前，清點(diǎn)、檢查儀器、明確儀器規(guī)范操作方法及注意事項(xiàng)，否則不得動(dòng)手操作。 5. 使用藥品時(shí)，要求明確其性質(zhì)及使用方法后，據(jù)實(shí)驗(yàn)要求規(guī)范使用。禁止使用不明確藥品或隨意混合藥品。 6. 實(shí)驗(yàn)中，保持安靜，認(rèn)真操作，仔細(xì)觀察，積極思維，實(shí)驗(yàn)過程中必須有原始記錄，不得擅自離開崗位。 7. 實(shí)驗(yàn)室公用物品（包括器材、藥品等）用完后，應(yīng)歸放回原指定位置。實(shí)驗(yàn)廢液、廢物按要求放入指定收集器皿。 8. 愛護(hù)公物，注意衛(wèi)生，保持整潔，節(jié)約用水、電、氣及器材。 9. 實(shí)驗(yàn)完畢后，要求整理、清潔實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，檢查水、電、氣源，打掃實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生。 10. 實(shí)驗(yàn)記錄經(jīng)教師簽名認(rèn)可后，方可離開實(shí)驗(yàn)室。 實(shí)驗(yàn)一 淀粉含量測(cè)定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 1. 掌握旋光儀的操作使用。 2. 了解旋光法測(cè)粗淀粉的基本原理。 二、實(shí)驗(yàn)原理 ? 在加熱及稀鹽酸的作用下 ， 淀粉水解并轉(zhuǎn)入鹽酸溶液中 。 在一定的水解條件下 ， 不同谷物淀粉的比旋光度是不同的 。 其在 171～ 195之間 ， 因此可用旋光法測(cè)定粗淀粉的含量 。 三、實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 主要儀器： （ 1）旋光儀 （ 2）電子天平（感量 ） 試劑： ⑴ 1％鹽酸溶液 ⑵ 30％硫酸鋅溶液。 ⑶ 15％亞鐵氰化鉀溶液。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 在電子天平上稱取小麥粉 →加入50ml 1%HCl混成漿狀（不能有結(jié)塊） →沸水浴中準(zhǔn)確加熱 15min→先加 1ml 30% ZnSO4混勻 →再加 1ml 15%亞鐵氰化鉀混勻 →移至 100ml容量瓶中加水定容混勻后過濾→棄去最初 15ml收集其余濾液。 取濾液 20ml置于旋光管中，先用 1%HCl 調(diào)節(jié)旋光儀“ 0”點(diǎn)，然后將樣品溶液放入旋光儀中測(cè) α 六、思考題 ? 樣品加鹽酸處理時(shí) ， 煮沸時(shí)間少于或多于 15min會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生什么影響 ？ ? 五 、 結(jié)果計(jì)算 ? ? 100.10020 ???WLD??淀粉含量（％）＝表 1－ 1不同 谷物 淀粉的比旋光度 品種 品種 小麥 馬鈴薯 黑麥 小米 大麥 蕎麥 水稻 燕麥 玉米 [α]D20 ? ?）：樣品質(zhì)量（ gdm2WLD???其中 ： 實(shí)驗(yàn)二 氨基酸的紙上層析 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 通過對(duì)氨基酸的分離 ， 學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法 。 二 、 實(shí)驗(yàn)原理 紙層析是以濾紙作為惰性支持物的分配層析 ， 濾紙纖維上的－ OH具有親水性 ， 因此能吸附一層水作為固定相 ， 而通常把有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相 。 有機(jī)溶劑自上而下流動(dòng) ， 稱為下行層析；自下而上流動(dòng) ， 稱為上行層析 。 流動(dòng)相流經(jīng)支持物時(shí)與固定相之間連續(xù)抽提 ， 使物質(zhì)在兩相之間不斷分配而得到分離 。 三、儀器和試劑 主要儀器： （ 1）層析缸 （ 2）微量進(jìn)樣器 （ 3）噴霧器 試劑 ： （ 1）展開劑：乙醇：水：冰乙酸＝ 50:10:1 （ 2）氨基酸溶液： %的賴氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸溶液及它們的混合液 （ 3）顯色劑： %水合茚三酮丙酮溶液。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 平衡：將展開劑 （ 乙醇：水：冰乙酸＝ 50:10:1） 放入培養(yǎng) 皿中置于密閉容器內(nèi)使其充滿展開劑 （ 24h左右 ） 點(diǎn)樣：取濾紙 1張用鉛筆在距下方 2cm處劃線并將所得線段分成 5等分從而得到 4個(gè)標(biāo)記點(diǎn) ， 用微量進(jìn)樣器分別取 5μl下列樣品 ① phe② lys③ pro④ 混合 Aa向 4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)上加樣 （ 樣品擴(kuò)散中216。≤1cm） 展層：將濾紙卷成筒狀且不能夠重疊 ， 并用棉線扎緊然后垂直放入培養(yǎng)皿中進(jìn)行展層 2h（ 當(dāng)展開劑沿到達(dá)濾紙長(zhǎng)度三分之二時(shí) ， 即可取出 ） 測(cè)量展開劑前沿移動(dòng)距離 （ a） 顯色：用 %茚三酮 丙酮溶液朝點(diǎn)樣面噴霧 （ 不要噴得太多 ） 然后將濾紙置于電爐上方 20cm處加熱直至斑點(diǎn)出現(xiàn)為止 ，測(cè)量各斑點(diǎn)中心到點(diǎn)樣點(diǎn)距離 （ b） ? 1．計(jì)算出各種氨基酸的 Rf值，并根據(jù) Rf值鑒定出混合氨基酸中的各組分，在層析圖譜上標(biāo)出各氨基酸名稱。 ? 2．對(duì)氨基酸移動(dòng)快慢的原因給予簡(jiǎn)要分析。 五、結(jié)果計(jì)算 六、思考題 ）展開劑前沿移動(dòng)距離（）（斑點(diǎn)中心到點(diǎn)樣點(diǎn)距離abR ?f實(shí)驗(yàn)三 蛋白質(zhì)分子量測(cè)定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握電泳基本原理 、 分類 、 影響因素 , SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳用途 ,凝膠制備 。 二 、 實(shí)驗(yàn)原理 聚丙烯 酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的方法，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)組分的分子大小和形狀以及所帶凈電荷多少等因素所造成的電泳遷移率的差別。 在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（ SDS），使所有蛋白質(zhì)顆粒表面覆蓋一層 SDS分子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間原有的電荷差異消失，此時(shí)，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在 15000～ 202200之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系。 三、儀器和試劑 1．主要儀器 （ 1）電泳儀 （ 2）電泳槽 2. 試劑 （ 1）電極緩沖液 （ 2） PH 凝膠緩沖液 （ 3） 1%TEMED， （ 4） 30%凝膠儲(chǔ)液， （ 5） 10%過硫酸銨 （ 6） %考馬斯亮藍(lán) R250染色液 （ 4） 10%乙酸脫色液 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 電泳槽的安裝：取兩塊玻璃板 →將帶玻璃條的板（高板）放置桌面上 →在上面放置“ U”型橡膠條 →最后將凹槽玻璃板（低板）壓在高板上，置于電泳槽內(nèi)，用鍥子壓緊。 2. 凝膠液的制備與灌裝：配置 20ml凝膠液：在小燒杯中依次加入 5ml 30%凝膠儲(chǔ)液， 10ml PH