【正文】 50℃ ，（ 2）用廣泛 pH試紙檢查清液（“粗級分 I”）的pH，用 1N乙酸將 pH調(diào)至 。 （ 3）將盛有粗級分 I的離心管穩(wěn)妥地放入水浴中，50℃ 下保溫 30分鐘，在保溫過程中不斷輕搖離心管。（ 4）取出離心管，于冰浴中迅速冷卻，平衡后 4℃ ， 10,000rpm，離心 10min。（ 5）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積（稱為“熱級分 II”）。取出 ，冷凍保存。 3. 乙醇沉淀 將熱級分 II轉(zhuǎn)入小燒杯中，放入冰浴中，逐滴加入等體積預(yù)冷至－ 20℃ 的 95%乙醇，同時輕輕攪拌，共需 30分鐘，以沉淀完全。于 4℃ ， 10,000rpm，離心 10min，傾去上清，并滴干。用 3mL， ， ，平均分成兩份（稱為“醇級分 Ⅲ ”），冷凍保存。 實(shí)驗(yàn)十一 :蔗糖酶活力的測定 ? 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 掌握蔗糖酶活性測定方法。了解各級分酶的純化情況。 ? 二、實(shí)驗(yàn)原理 ? 為了評價酶的純化效果，必須測定各級分酶的活性和比活性。 ? 測定蔗糖酶活性的方法有許多種，如費(fèi)林試劑法、Nelson’ s試劑法、水楊酸試劑法等， ? 本實(shí)驗(yàn)使用費(fèi)林試劑法。其原理是在酸性條件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。這些具有還原性的糖與堿性銅試劑混合加熱后被氧化，二價銅被還原成棕紅色氧化亞銅沉淀，氧化亞銅與磷鉬酸作用，生成藍(lán)色溶液，其藍(lán)色深度與還原糖的量成正比，于 650nm測定光吸收值。 ? 三、試劑和器材 ? （一）試劑： ? 1. 堿性銅試劑：稱 10g無水 NaCO3，加入 100mL去離子水溶解，另稱，用 100mL去離子水溶解，混合二溶液，再加入 晶 CuSO4，溶解后定容到 250mL。 ? 2. 磷鉬酸試劑：在燒杯內(nèi)加入鉬酸 ，鎢酸鈉 ， 10% NaOH 100mL, 去離子水 100mL，混合后煮沸約 30min（小心不要蒸干），驅(qū)去鉬酸中存在的氨，直到無氨味為止，冷卻后加 85%磷酸 63mL,混合并稀釋到 250mL。 ? 3. %苯甲酸 200mL，配葡萄糖用，防止時間長溶液長菌，也可以用去離子水代替。 ? 4. 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：（ 1）貯液：精確稱取無水葡萄糖（應(yīng)在 105℃ 恒重過） ，以 %苯甲酸溶液溶解后，定容到 100mL容量瓶中（濃度 10mmol/L）。 （ 2）操作溶液：用移液管取貯液 10mL，置于50mL容量瓶中，以用 %苯甲酸或去離子水稀釋至刻度（濃度為2mmol/L）。 ? 5. ，分裝后冰凍保存，因蔗糖極易水解，用時取出一管化凍后搖勻。 ? 6. ， ， 200mL。 ? （二）器材： ? 1. 試管 20支，試管架 1個 2. 秒表 1塊，或用手表。 3. 移液管： 、 、 4. 水浴鍋 5. 電爐 6. 橡皮筋 7. 保鮮膜 ?四、操作方法 ? 級分 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 酶活力的測定： ? 1. 用蒸餾水稀釋各級分酶液（約 5,000倍。根據(jù)純化后酶活力大小可在實(shí)驗(yàn)十二稀釋液的基礎(chǔ)上進(jìn)一步稀釋）。 ? 2. 按下頁“表 1”的順序在試管中加入各試劑（ mL），進(jìn)行測定。 ? 表 1 級分 Ⅰ 、 II、 III的酶活力測定 各管名稱 對照 粗級分 Ⅰ 熱級分 Ⅱ 醇級分 Ⅲ 葡萄糖 管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 酶液 0 0 0 H2O 乙酸緩沖液 0 0 葡萄糖 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 蔗糖 0 0 加入蔗糖，立即搖勻開始計(jì)時，室溫準(zhǔn)確反應(yīng) 10分鐘 堿性銅試劑 沸水浴加熱 8分鐘 磷鉬酸試劑 H2O A650nm E’ 平均 ’ 原始酶液 ’ ? 五、結(jié)果計(jì)算 ? 1. 稀釋后酶液的活力（按還原糖計(jì)算）： ? 式中： A650：第 2~10管所測 A650 A’ 650：第 12管所測 A650 ：第 12管葡萄糖取樣量 2：標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度（ 2mmol/L = 2μmol/mL） 10：反應(yīng) 10min B：每管加入酶液的毫升數(shù)。 ? 2. 原始酶液的酶活力 E = (平均 E’ /2)稀釋倍數(shù)（ Units / mL原始組分） ? ［注］：一個酶活力單位 Units，是在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘能催化1mole蔗糖水解所需的酶量，而水解 1mole蔗糖則生成 2moles還原糖，計(jì)算時請注意。 ? ? ： 注：蛋白含量 =蛋白濃度 校正體積 總酶活 =酶活稀釋倍數(shù) 比活力 =總酶活 /總 蛋白含量 純化倍數(shù) =比活力之比 回收率 =總酶活 之比 為了測定和計(jì)算下面純化表中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，對各個級分都必須取樣，每取一次樣，對于下一級分來說會損失一部分量，因而要對下一個級分的體積進(jìn)行校正，以使回收率的計(jì)算不致受到不利的影響。 級分 記錄體積 校正體積 蛋白質(zhì)(mg/mL) 總蛋白 活力 總活力Units 比活力 純化倍數(shù) 回收率 I 100 Ⅱ III 表 2 酶的純化表 表 3 記錄體積的校正 級分 記錄體積 核正體積計(jì)算 取樣體積 校正后體積 I 15 15 Ⅱ （ 15/） III 3 3 (15/) (12) 0 實(shí)驗(yàn)十二 Bradford法測定蛋白質(zhì)含量 ? 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 了解各種蛋白質(zhì)含量測定方法的優(yōu)缺點(diǎn)，掌握 Bradford法測定蛋白質(zhì)含量的原理及方法。 ? 二、原理 ? 考馬斯亮蘭 G250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（ max）由 465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在 595nm下測定的吸光度值 A595與蛋白質(zhì)濃度成正比。 ? Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：（ 1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比 Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá) 1g/mL。（ 2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要 5分鐘左右。（ 3）干擾物質(zhì)少。 – 三、試劑與器材 – 1. 試劑： – （ 1） – （ 2）染料試劑： ∕mL 考馬斯亮蘭 G250 – 2. 器材： – （ 1）可見光分光光度計(jì) – （ 2）離心機(jī) （ 3）加完試劑后混勻。 5分鐘后，以一號管為空白測定各管的 A595。 （ 4）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，用吸光度值 A595為縱坐標(biāo)作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的 A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。 /mL溶液的 A595約為 。 1 2 3 4 5 6 7 11 12 21 22 31 32 清白蛋白 0 粗級分 熱級分 醇級分 蒸餾水 0 0 0 0 染料試劑 蛋白質(zhì)含量 A595 四、操作方法 （ 1）取級分 I、級分 II、級分 III各 ，分別用蒸餾水稀釋 50倍。 （ 2）取 13支試管，按下表編號并添加各種試劑（ mL）。