【正文】 1 2 3 4 5 6 7 11 12 21 22 31 32 清白蛋白 0 粗級(jí)分 熱級(jí)分 醇級(jí)分 蒸餾水 0 0 0 0 染料試劑 蛋白質(zhì)含量 A595 四、操作方法 （ 1）取級(jí)分 I、級(jí)分 II、級(jí)分 III各 ，分別用蒸餾水稀釋 50倍。 5分鐘后，以一號(hào)管為空白測(cè)定各管的 A595。（ 2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。 ? 二、原理 ? 考馬斯亮蘭 G250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（ max）由 465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。 ? 表 1 級(jí)分 Ⅰ 、 II、 III的酶活力測(cè)定 各管名稱 對(duì)照 粗級(jí)分 Ⅰ 熱級(jí)分 Ⅱ 醇級(jí)分 Ⅲ 葡萄糖 管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 酶液 0 0 0 H2O 乙酸緩沖液 0 0 葡萄糖 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 蔗糖 0 0 加入蔗糖，立即搖勻開(kāi)始計(jì)時(shí)，室溫準(zhǔn)確反應(yīng) 10分鐘 堿性銅試劑 沸水浴加熱 8分鐘 磷鉬酸試劑 H2O A650nm E’ 平均 ’ 原始酶液 ’ ? 五、結(jié)果計(jì)算 ? 1. 稀釋后酶液的活力（按還原糖計(jì)算）： ? 式中： A650：第 2~10管所測(cè) A650 A’ 650：第 12管所測(cè) A650 ：第 12管葡萄糖取樣量 2：標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度（ 2mmol/L = 2μmol/mL） 10：反應(yīng) 10min B：每管加入酶液的毫升數(shù)。 ? （二）器材： ? 1. 試管 20支，試管架 1個(gè) 2. 秒表 1塊，或用手表。 ? 4. 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：（ 1）貯液：精確稱取無(wú)水葡萄糖（應(yīng)在 105℃ 恒重過(guò)） ，以 %苯甲酸溶液溶解后，定容到 100mL容量瓶中（濃度 10mmol/L）。這些具有還原性的糖與堿性銅試劑混合加熱后被氧化，二價(jià)銅被還原成棕紅色氧化亞銅沉淀，氧化亞銅與磷鉬酸作用，生成藍(lán)色溶液，其藍(lán)色深度與還原糖的量成正比，于 650nm測(cè)定光吸收值。了解各級(jí)分酶的純化情況。 3. 乙醇沉淀 將熱級(jí)分 II轉(zhuǎn)入小燒杯中，放入冰浴中，逐滴加入等體積預(yù)冷至－ 20℃ 的 95%乙醇，同時(shí)輕輕攪拌，共需 30分鐘，以沉淀完全。 （ 3）將盛有粗級(jí)分 I的離心管穩(wěn)妥地放入水浴中，50℃ 下保溫 30分鐘，在保溫過(guò)程中不斷輕搖離心管。（ 6）用滴管小心地取出脂肪層下面的水相，轉(zhuǎn)入另一個(gè)清潔的離心管中，兩組平衡后， 4℃ ， 10,000rpm，離心10min。以便將蔗糖酶充分轉(zhuǎn)入水相。 三、試劑與器材： 1. 試劑： （ 1）啤酒酵母 （ 2） 甲苯（使用前預(yù)冷到 0℃ 以下） （ 3） 1N乙酸 （ 4） 95%乙醇（預(yù)冷至－ 20℃ ） (5) (6)預(yù)冷蒸餾水 2. 器材： （ 1）研缽 1個(gè) （ 2）恒溫水浴 （ 3）廣泛 pH試紙 （ 4）高速冷凍離心機(jī) 四、操作步驟： 1. 提取 （ 1）準(zhǔn)備一個(gè)冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中（兩組做一個(gè)）。該酶以兩種形式存在于酵母細(xì)胞膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞膜外細(xì)胞壁中的稱之為外蔗糖酶（ external yeast invertase） , 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有 50% 糖成分的糖蛋白。 ? 注意事項(xiàng)： ? ，避免使凝膠暴露于空氣中 ? 2. 凝膠過(guò)濾上樣時(shí)，使樣品沿管壁緩緩流下，勿沖破膠面 實(shí)驗(yàn)十：酵母蔗糖酶的提取及部分純化 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模? 學(xué)習(xí)酶的提取和純化方法，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供一定量的蔗糖酶。 ? 儀器參數(shù)設(shè)置及調(diào)整：①紫外檢測(cè)儀：當(dāng)檔位置于 100%T時(shí)，調(diào)光量至數(shù)顯為 100。因此，在洗脫小分子物質(zhì)后流出（洗脫體積大），從而達(dá)到分離的目的。 ? B= 實(shí)驗(yàn)九、凝膠層析法分離蛋白質(zhì) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 學(xué)習(xí)凝膠層析法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理，了解凝膠層析法的操作方法。本實(shí)驗(yàn)分別用茚三酮溶液顯色法和染料結(jié)合法，測(cè)定小麥種子中賴氨酸含量。 ? 4. RNA含量測(cè)定 ? （ 1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：（每 4組 8人做 1標(biāo)準(zhǔn)曲線） 編號(hào) 1（空白） 2 3 4 5 6 50ug∕㎎ RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液（ mL） 0 蒸餾水（ mL） . 0 地衣酚 銅離子 試劑（ mL） 2 2 2 2 2 2 沸水加熱 25分鐘后冷卻至室溫 A670 0 ? 以 RNA微克數(shù)為橫坐標(biāo)，以 A670為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 。 ? （ 2）核糖： ? 取水解液 1mL于試管中加入三氯化鐵濃鹽酸溶液 40滴和苔黑酚乙醇溶液 4滴。稱量所得 RNA粗品和濾紙重 W2。加畢，靜置，待 RNA沉淀完全后， 3000r/min離心3min。 ? （ 11）鉬酸銨試劑 ? （ 12） 50ug∕㎎ RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液 ? （ 13）苔黑酚 (3,5二羥基甲苯 )乙醇溶液 ? （ 14）地衣酚 銅離子試劑 ? （ 15） NaOH溶液 ? 器材：（ 1）離心機(jī) ? （ 2）分光光度計(jì) ? （ 3）抽濾裝置。 （ 3）嘌呤堿與硝酸銀反應(yīng)可生成白色的嘌呤銀化物沉淀。 ? （ 3）掌握地衣酚顯色法測(cè)定酵母 RNA含量的原理和方法 二、實(shí)驗(yàn)原理 ? 酵母含 RNA達(dá) — %，以酵母為原料使用稀堿使酵母裂解，然后用酸中和 ,除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀 RNA。 ? 3．中性甲醛需臨用前配制。 C：滴定時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的濃度（ ／ L） . ： lml lmol／ L氫氧化鈉相當(dāng)于氮的質(zhì)量（ mg）。 ? 氨基酸為兩性離子，在水溶液中有下列平衡： ? RCHCOO +2HCHO ＝ RCHCOO + H+ ? ↓ ↓ ? NH3+ N(CH2OH)2 ? ? 常溫下甲醛能迅速與氨基酸的氨基結(jié)合生成亞羥甲基化合物，使上述平衡右移促使 NH3+釋放 H+，從而使溶液酸度增加，滴定終點(diǎn)移至酚酞的變色域內(nèi)（ pH值 ），根據(jù)滴定終點(diǎn)時(shí)所消耗標(biāo)準(zhǔn)堿的量即可算出反應(yīng)體系中存在的游離氨基即氨基氮的含量如果樣品為一種已知的氨基酸，即可算出該氨基酸的含量。 ? 2．掌握甲醛滴定法的原理及應(yīng)用。 ? V0：滴定空白消化液用去的鹽酸溶液平均毫升數(shù)。將其置于冷凝管下端并使管尖插入液面以下，再吸取 5ml消化液從漏斗上方加入蒸餾室內(nèi)用水洗兩次，并加入 10ml 40%NaOH后水封（注意：勿使漏斗內(nèi)玻桿取下以防漏氣），然后打開(kāi)通氣閥進(jìn)行加熱蒸餾，直至吸收液由紫紅色變成綠色，計(jì)時(shí)蒸餾 3min→先移去吸收液再停止加熱以防倒吸。 濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定濃度的過(guò)量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氫離子濃度降低，然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸滴定，直到恢復(fù)溶液中原來(lái)氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)