流式細(xì)胞術(shù)在哺乳動(dòng)物精液質(zhì)量檢測(cè)中的應(yīng)用(參考版)
2025-07-10 15:11本頁面
【正文】 10 / 10。圖10 TUNEL檢測(cè)精子凋亡。 選出精子。A，C 為生育組精子；圖9 Annexin V/PI雙標(biāo)記檢測(cè)精子凋亡。 的活精子；Monomers為線立體功能低的活精子。 圖8 JC1/PI雙標(biāo)記檢測(cè)精子線立體功能。可分為四群：Mero +/Yopro –分為四群：FITCPNA+/PI – 為頂體反應(yīng)的活精子； 為獲能的活精子；Mero +/Yopro I +為獲能的死精子；FITCPNA+/PI +為頂體受損的死精子；FITCPNA–/PI Mero–/Yopro –為未獲能的活精子；Mero–/Yopro +為死精為頂體完整的活精子；FITCPNA–/ PI +為頂體完整 子的死精子。B為對(duì)照，B為對(duì)照，C為誘導(dǎo)頂體反應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果。 H 為雙陽性；E為死精子（CFDA/PI+） 值低的為活精子；低綠光，高紅光的為 死精子；高綠光，高紅光的為頂體受損 的死精子 圖5：FITCPNA/PI雙標(biāo)記檢測(cè)精子頂體狀態(tài)。陽性為死精子，雙陽性處于從活到 Region G為活精子（CFDA+/PI）； 左下角為雜質(zhì)。 圖1：SYBR14陽性為活精子，PI 圖2：CFDA/PI雙標(biāo)記測(cè)精子活力。目前，我室已成功地將FCM用于獼猴（Macaca mulatta）、食蟹猴（Macaca fascicularis）鮮精及凍精質(zhì)量的檢測(cè)，利用Hoechst 33342/PI/R123 三色標(biāo)記，可同時(shí)檢測(cè)精子活力和線粒體功能；利用Hoechst 33342/PI/FITCPNA三色標(biāo)記，同時(shí)檢測(cè)精子活力和頂體狀態(tài)（資料待發(fā)表）。但FCM應(yīng)用于精液質(zhì)量的檢測(cè)，很多還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)檢測(cè)是預(yù)測(cè)精子生育力的最佳指標(biāo)，這一方法在人類輔助生殖技術(shù)和家畜生殖工程中得到了重視和推廣，且樣品可冷凍待測(cè)，運(yùn)輸方便，使SCSA應(yīng)用非常靈活。FCM的優(yōu)點(diǎn)是可以快速地同時(shí)測(cè)定多個(gè)指標(biāo)；只有樣品中的顆粒被檢測(cè)，不必洗掉游離的染料；大多數(shù)試驗(yàn)也不需要固定，這種方法很適合自然狀態(tài)下的精子的檢測(cè)。精子需要同時(shí)具備多種特性和功能才能受精，因而任何單獨(dú)一種參數(shù)都無法完全反映其生育力。7 總結(jié)與展望精子檢測(cè)的首要目標(biāo)就是快速準(zhǔn)確地確定其生育力。該方法與血球計(jì)數(shù)儀檢測(cè)相比，變異性很小。Evenson et al(1993)曾經(jīng)介紹過一種用AO或PI標(biāo)記精子DNA，結(jié)合已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)熒光微球來計(jì)算牛精子濃度的方法。通常用血球記數(shù)儀來計(jì)數(shù)，但該方法準(zhǔn)確性差。Annexin V /PI雙染法可檢測(cè)精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性，TUNEL可檢測(cè)精子DNA是否斷裂。Gadella et al(2002)發(fā)現(xiàn)，豬精子獲能后可檢測(cè)到高水平的PS,但TUNEL法檢測(cè)無顯著變化，推測(cè)精子不出現(xiàn)凋亡。Sun et al（1997）用TUNEL法檢測(cè)人精子DNA的片斷化，發(fā)現(xiàn)DNA的片斷化與精子活動(dòng)率、正常形態(tài)、精子濃度、體外受精率、胚胎發(fā)育率成反比；吸煙者比不吸煙者精子DNA的片斷化比例要高。Annexin V /PI雙染法檢測(cè)到的鮮精活力小于SYBR14/PI雙染的測(cè)量值。Anzar et al(2002)用上述兩種方法檢測(cè)了牛新鮮精液和凍精的凋亡情況，并與繁殖率作了比較，兩種方法都檢測(cè)到冷凍使精子凋亡率升高，TUNEL法檢測(cè)到的鮮精凋亡率高于Annexin V/PI雙染法。精子冷凍后其Annexin V陽性率明顯升高，并同精子的不同運(yùn)動(dòng)參數(shù)高度相關(guān)。兩種方法相比，Annexin V /PI聯(lián)染法樣品不需固定，更方便易行。TUNEL法的原理是：凋亡細(xì)胞DNA斷裂后，其缺口3?端可在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用下結(jié)合FITC標(biāo)記的dUTP，或者結(jié)合BrdU，BrdU再與FITC標(biāo)記的抗體孵育。Annexin V /PI雙染法的原理是：在凋亡的早期階段，磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)層轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外層；Annexin V為一種依賴于Ca2+的磷脂蛋白（一般用FITC標(biāo)記），對(duì)PS有高度的親和力，可用來探測(cè)PS是否暴露在細(xì)胞膜外表面；結(jié)合PI染色，可區(qū)分壞死和凋亡。而FCM被認(rèn)為是當(dāng)今檢測(cè)凋亡最敏感、最可靠的手段。5 檢測(cè)精子凋亡盡管精子作為一種終端的不能分裂的細(xì)胞，是否存在凋亡目前尚無定論。 Thomas,1999)。Thomas et al(1998)用JC1和PI聯(lián)合使用對(duì)牛精子線粒體功能進(jìn)行檢測(cè)，能分辨出精子死活和線粒體功能的高低，并證明JC1是檢測(cè)精子經(jīng)過冷凍過程后受損程度的最可靠指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)精子攝取R123到達(dá)平衡的速度較快，只需10min；R123陽性率與精子活動(dòng)性相關(guān)，反映線粒體的功能變化。線粒體特異的熒光探針經(jīng)常和檢測(cè)精子活力的探針同時(shí)使用。用JC1對(duì)大鼠精子檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)在精子中段線粒體部位發(fā)黃色或綠色熒光，反映其膜電位的高低，說明JC1對(duì)精子線粒體染色的特異性很好；流式檢測(cè)JC1的染色模式與分組精子的預(yù)期結(jié)果高度相關(guān)（Gravance et al，2001)。其中，JC1的陽性率最高，MITO的最低；R123和MITO只有一群陽性，而JC1可反映出線粒體膜電位高低的兩群；JC1染色的特異性最好，僅在線粒體部位發(fā)黃色或綠
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